Diffuse low grade gliomas with secondary malignancy : immunohistochemical and cytogenetic profile study

Tese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019Os gliomas são os tumores primários mais frequentes do Sistema Nervoso Central, representando 50% de todos os casos de tumores cerebrais. Incluem, entre outros, os astrocitomas (AT) e os oligodendrogliomas (OLG). Uma designação comum para estes tumores, quando se localizam num ou mais lobos cerebrais, na região supratentorial é a de gliomas difusos e atingem, caracteristicamente, jovens adultos. Esses dois tipos de gliomas são considerados de baixo grau e são infiltrativos, de crescimento lento. Os gliomas de baixo grau – grau II, pela Organização Mundial de Saúde – tem uma forte tendência para a progressão maligna, para gliomas anaplásicos (grau III, pela OMS) e até glioblastomas secundários (grau IV, pela OMS), o que, muitas vezes, ocorre após alguns anos, geralmente, entre cerca de 4 a 5. Muitas vezes, após uma resseção cirúrgica de gliomas de baixo grau, as células neoplásicas deixadas no cérebro podem originar um tumor recidivante, que muitas vezes se transforma em glioma de alto grau, com prognóstico variável a longo prazo e uma taxa de sobrevida de entre 5 a 8 anos. A nova classificação da OMS, no que diz respeito a Tumores do Sistema Nervoso Central, revista em 2016, introduziu parâmetros moleculares como mutações IDH, co-deleções de 1p/19q e perdas de ATRX, agrupando os tumores em categorias de acordo com seus perfis genéticos, além dos padrões histológicos usados até então. Sendo assim, é possível classificar os gliomas difusos em astrocitomas, IDH mutantes; oligodendrogliomas, IDH mutantes e 1p/19q co-deletados; astrocitomas IDH wild-type; glioblastomas IDH mutantes; glioblastomas IDH wild-type; oligodendrogliomas sem outras especificações; astrocitomas sem outras especificações; oligoastrocitomas sem outras especificações e glioblastomas sem outras especificações. Os critérios usados para definir o grau de anaplasia dos gliomas, definidos pela OMS, são polimorfismo nuclear e hipercromasia, índice mitótico, proliferação endotelial da microvascularização tumoral e necrose do parênquima tumoral. Estes critérios permitem aos patologistas classificar os gliomas difusos em diferentes graus de malignidade, desde grau II, o menos maligno, até aos graus III e IV, os mais malignos, dos quais o glioblastoma é o mais comum. As alterações moleculares no processo de tumorigénese levam à ativação de oncogenes ou à inativação de genes supressores de tumor. Alguns dos marcadores genéticos de grande relevância no processo de tumorigénese e na determinação do tipo e grau de anaplasia dos gliomas difusos são o 1p/19q (co-deleção), o EGFR, o PTEN e o CDKN2A. A presença de mutação do ATRX ajuda ao diagnóstico dos AT com IDH mutante, distinguindo-os dos OLG. Os AT anaplásicos com mutações combinadas no ATRX e no IDH têm melhor prognóstico do que os que só têm a mutação do IDH. As mutações no codão 132 do gene IDH ocorrem cedo e a uma frequência elevada em AT, OLG de graus II e III, e em glioblastomas secundários desenvolvidos a partir de AT. Os objetivos deste estudo são comparar o perfil imunohistoquímico e as alterações citogenéticas encontradas em 16 casos de doentes com cirurgia a gliomas primários de baixo grau, e a recidiva de grau mais elevado, resultando num total de 32 amostras – 18 oligodendrogliomas, 10 astrocitomas, 3 oligoastrocitomas e 1 gliossarcoma; avaliar e quantificar as alterações e identificar subpopulações baseadas em marcadores, nas amostras de tumores de ambas as cirurgias. Para isso, obtiveram-se lâminas de imunohistoquímica e fizeram-se blocos de Tissue Micro Arrays, dos quais se obtiveram lâminas para Hibridação In Situ por Fluorescência. As proteínas estudadas foram GFAP, IDH1, KI-67, ATRX e Olig-2, e os genes foram CDKN2A, p53, EGFR, PTEN, 1p e 19q. Realizou-se a técnica de imunohistoquímica para os marcadores IDH, ATRX e GFAP, posteriormente fotografados no microscópio ótico, e analisados com programa Image-J (plugin Colour Deconvolution). Às áreas de interesse foram-lhes atribuídas cores secundárias (cada uma associada a um marcador) e as imagens resultantes foram sobrepostas originando áreas de cores primárias. Foi calculado o rácio de pixéis de cada cor de interesse. Realizou-se igualmente a técnica de imunohistoquímica para os marcadores Olig-2 e KI-67, também fotografados no microscópio ótico e analisados no programa Image-J (plugin ImmunoRatio). Realizou-se ainda Hibridação in situ de fluorescência, para analisar os genes CDKN2A, p53, EGFR, PTEN, 1p e 19q, em lâminas de Tissue Micro Array, que foram fotografadas no microscópio de fluorescência e analisadas no programa Image-J (plugin Cell Counter para contagem dos núcleos). Este estudo incluiu 18 oligodendrogliomas, 10 astrocitomas, 3 oligoastrocitomas e 1 gliossarcoma. A análise foi feita inicialmente para os marcadores individuais e, em seguida, para as subpopulações definidas, baseadas na classificação actual de gliomas difusos. Nenhuma das amostras estudadas apresentou deleção do gene supressor tumoral PTEN. O estudo de EGFR mostrou amplificação em apenas 6 das 32 amostras, sendo 4 exclusivamente nas recidivas e 1 exclusivamente num tumor primário de baixo grau. O p53 estava mutado em 6 das 32 amostras estudadas, sendo que 4 desses 6 tumores com mutação eram recidivas. Analisando as alterações de primários para recidivas, encontraram-se 4 casos com p53 wild-type no primário e mutação nas recidivas e 1 caso que manteve a mutação em ambos os grupos. O CDKN2A estava deletado no primário e na recidiva em simultâneo, em apenas 1 caso. 6 casos tinham deleções nos primários e apenas 3 tinham deleções nas recidivas. A expressão de KI-67 apresentou valores mais elevados nas recidivas do que nos primários. Relativamente à expressão de Olig-2, observou-se o contrário, sendo os valores mais elevados nos primários do que nas recidivas. Não se encontraram diferenças major nas três subpopulações estudadas (IDH1mut/ATRXloss, IDH1mut/ATRX/1p/19q co-deletadas e IDH1wt) entre as amostras de tumores primários e as suas respectivas recidivas. Descobriram-se mais células tumorais IDH1mut/ATRXloss em recidivas (9799±24384) do que em primários (5053±10116), e mais células tumorais IDH1- em primários (671939±180448) do que nas recidivas (609653±284091). Contudo, estas diferenças não foram muito evidentes. Células IDH1mut/ATRX/1p/19q co-deletadas foram encontradas em apenas um dos dezasseis casos estudados. As proteínas e genes estudados cobrem a maioria das principais vias de sinalização molecular que levam ao desenvolvimento de carcinomas. Contudo, a ausência de variações muito evidentes entre os dois grupos comparados (primário e respetiva recidiva) indica que poder-se-á não estar a estudar os marcadores mais relevantes para esta evolução. Outros marcadores que poderão ser relevantes são o PDGF e o Ras. O PDGF é um agente mitogénico de células mesenquimais, incluindo células gliais e já foi associado a glioblastomas (vias PI3k/AKT e Ras-Raf-Mek-Erk). O gene Ras foi o primeiro oncogene humano a ser identificado e sabe-se que está mutado em cerca de um terço dos carcinomas. Estes são apenas dois exemplos de outras moléculas que podem ser estudadas nos gliomas. Este estudo é um passo noutra direcção, no que diz respeito aos marcadores biológicos em gliomas. Os resultados obtidos levantam variadas questões face aos marcadores estudados e oferecem uma série de sugestões de outros a considerar; e, uma vez que não há bibliografia de suporte, seria interessante continuar a estudar esta linha de progressão tumoral do primário para a recidiva. O objetivo não seria apenas caracterizar subgrupos histológicos de gliomas do ponto de vista genético e molecular mas também, e acima de tudo, tentar compreender a evolução do tumor primário e os mecanismos e ferramentas biológicas presentes no próprio, que lhe permite recidivar com um nível de malignidade superior. Se se conseguir prever estas transformações no tempo, poder-se-á tentar controlar a progressão da doença logo desde o momento do diagnóstico.The most frequent primary tumors of the Central Nervous System are gliomas, representing 50% of all brain tumor cases, which include, among others, astrocytomas and oligodendrogliomas. Those two types of gliomas, considered low-grade gliomas, are infiltrative and slow-growing. Low-grade gliomas (World Health Organization grade II) have a strong tendency for malignant progression to anaplastic gliomas (World Health Organization grade III) and even secondary glioblastomas (World Health Organization grade IV), which often takes place after a few years, usually about 4 to 5. Indeed, after a surgical resection of LGG, cancerous cells left in the brain can give rise to a recurrent tumor, often transformed in a high-grade glioma, with variable long-term prognoses and a survival rate between 5 to 8 years. The new World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System, revised in 2016, introduced molecular parameters, such as IDH mutations, 1p/19q co-deletions and ATRX losses, for grouping tumors into categories according to their genetic profiles besides the histologic patterns used until then. The aim of this study is to compare immunohistochemical profile and cytogenetic changes in 16 cases with two different surgeries from the same patient, treated for recurrences, evaluate and quantify those changes and identify marker based subpopulations in tumour samples from both surgeries. The proteins studied were GFAP, IDH1, KI-67, ATRX and Olig-2, and the genes were CDKN2A, p53, EGFR, PTEN, 1p and 19q. We did not found major differences in the populations we studied (IDH1mut/ATRXloss, IDH1mut/ATRX/1p/19q co-del and IDH1wt) between primaries and their relapses. However, differences were found in Ki-67, Olig-2, EGFR and CDKN2A between the two groups studied (primary tumors and relapses). All proteins and genes studied cover most of the main pathways that lead to cancer development, which may lead us to think that we are looking at the wrong set of markers. We found some results that suggest it should be interesting to continue this type of research of comparing primary tumors with their own relapses, and try to understand what makes tumors relapse in a much more aggressive form, in order to control the progression of the disease right in the moment of the diagnosis