Molecular and physiological caracterization of Patagonian strains of S. eubayanus, S. uvarum and interspecific hybrids for winemaking

Aunque diversos microorganismos participan del proceso de vinificación, son las levaduras, especialmente Saccharomyces cerevisiae, las responsables de llevar a cabo la fermentación alcohólica. Sin embargo, otras especies de levaduras comoSaccharomyces uvarum e incluso híbridos entre diferentes especies del géneroSaccharomyces también han sido aisladas de algunas vinificaciones. En particular, estasotras levaduras pueden incluso predominar en fermentaciones llevadas a cabo a bajastemperaturas dado su carácter criotolerante que en el caso de los híbridos estádeterminado por su parental no-S. cerevisiae. Además de la capacidad de fermentar abajas temperaturas, los híbridos pueden adquirir de sus parentales otras propiedadesfisiológicas de interés en vinificación, por lo que la generación de híbridos artificialesresulta una estrategia de gran interés para el desarrollo de nuevos cultivos iniciadorespara vinificación. El objetivo de esta Tesis fue seleccionar cepas de levaduraspatagónicas criotolerantes de las especies Saccharomyces uvarum y Saccharomyceseubayanus para ser usadas en la generación de híbridos interespecíficos con una cepavínica de S. cerevisiae. Las cepas híbridas obtenidas podrían presentar característicasgenéticas interesantes, adquiridas de ambos parentales, posibilitando la obtención devinos con características organolépticas diferenciales.Para ello se evaluaron diversas características de interés enológico de 32 cepas nativas(aisladas, identificadas y caracterizadas molecularmente en trabajos previos) incluyendosu capacidad fermentativa, su respuesta a condiciones de estrés típicas defermentaciones vínicas y algunas actividades enzimáticas y antimicrobianas de interésenológico. Tres cepas resultaron seleccionadas por sus características destacadas: dos deS. uvarum aisladas de diferentes ambientes (una de A. araucana y una de chicha demanzana) y una de S. eubayanus (de A. araucana). Para la generación de híbridosinterespecíficos se utilizó el método conocido como conjugaciones raras o rare-mating.En primer lugar, se generaron híbridos entre las dos cepas de S. uvarum y una mismacepa de S. cerevisiae (S. cerevisiae x S. uvarum) a dos temperaturas: 13°C y 20°C. Seobtuvieron híbridos de los dos cruces y a ambas temperaturas. Se observaron diferenciascinéticas y de tiempos totales de fermentación durante los procesos de estabilizacióngenética a las dos temperaturas. No obstante, los vinos blancos obtenidos utilizandomosto Sauvignon blanc con estos híbridos no presentaron diferencias significativas ensus principales características fisicoquímicas ni aromáticas, aunque sí fueron diferentesa los obtenidos con sus parentales. Los vinos jóvenes producidos por los híbridospresentaron valores elevados de 1-propanol y ácido málico mientras que los producidospor el parental S. cerevisiae evidenciaron elevadas concentraciones de etanol, 1-hexanol, acetato de hexilo, de isoamilo y de isobutilo, y octanoato y butirato de etilo.Por su parte, los vinos obtenidos con los parentales S. uvarum mostraron valoreselevados de glicerol, ácido shikímico y 2-feniletanol.En base a los resultados obtenidos y utilizando la misma metodología, segeneraron híbridos entre la cepa seleccionada de S. eubayanus y la misma cepa de S.cerevisiae (S. cerevisiae x S. eubayanus) a 20ºC. Un híbrido de este nuevo cruce, unodel cruce S. cerevisiae x S. uvarum y las respectivas cepas parentales se emplearoncomo cultivo iniciador para conducir fermentaciones a escala piloto en mostoSauvignon blanc, sin esterilizar, a baja temperatura (13ºC). Todas las fermentacionesfinalizaron exitosamente, aunque los porcentajes de implantación, evaluado mediantemétodos moleculares, y el tiempo total requerido para finalizar las fermentaciones encada caso fueron diferentes. El análisis aromático y sensorial evidenció diferenciasiisignificativas entre los diversos vinos obtenidos y estudios de preferencia deconsumidores demostraron que mientras el híbrido S. cerevisiae x S. eubayanus fuepreferido en comparación con sus parentales, la preferencia del híbrido S. cerevisiae x S.uvarum y sus parentales fue muy pareja, aunque todos coincidieron en que todos losvinos fueron diferentes.El análisis de respuesta a los factores de estrés comparado entre híbridos yparentales demostró que S. eubayanus y S. cerevisiae fueron menos afectadas porconcentraciones crecientes de glucosa y etanol, mientras que los híbridos presentaron unmayor rango de crecimiento que los parentales ante diferentes temperaturas decrecimiento. A su vez, ensayos en mostos sintéticos con elevado contenido de fructosa yetanol, imitando paradas de fermentación, demostraron ventajas de los híbridos respectoa las cepas parentales, particularmente a temperaturas bajas. En ensayos de laboratoriolos híbridos presentaron requerimientos de nitrógeno intermedios en mosto sintético.Por ello, se procedió a evaluar esta característica en otras cepas de S. uvarum y S.eubayanus en ensayos en microplacas, en fermentaciones individuales y encompetencias a diferentes temperaturas (12, 20 y 28°C). Estos ensayos evidenciaron laexistencia de cepas con bajo requerimiento de nitrógeno y capaces de competir con S.cerevisiae, que podrían ser parentales para el desarrollo de nuevos híbridos orientados aser utilizados en mostos pobres en compuestos nitrogenados.Although diverse microorganisms are involved in the winemaking process, yeasts, and specially Saccharomyces cerevisiae, are the main responsible for alcoholic fermentation. Nevertheless, some other yeasts like Saccharomyces uvarum and hybrids among different species from the Saccharomyces genus have been also isolated from some wines. In particular, these other yeasts are also able to dominate winemaking processes carried out at low temperature because of their cryotolerant behavior that, in the case of hybrid strains is determined by the Saccharomyces no-cerevisiae parent. Additionally, to the ability to ferment at low temperature, hybrids can acquire some other features of interest in oenology from their parental strains. In that sense, artificial hybrids generation became an interesting strategy for the development of new yeast starter cultures for winemaking. The aim of this Thesis was to select Patagonian cryotolerant yeast strains from S. uvarum and Saccharomyces eubayanus species to be used in the generation of interspecific hybrids with a S. cerevisiae wine strain. Hybrid strains obtained could show interesting features, inherited from the two parents, allowing the production of wines with differential organoleptic characteristics. Diverse oenological features were analyzed in 32 native strain yeasts (isolated, identified and molecularly characterized in previous works) including fermentative performance, tolerance to different winemaking stress conditions as well as some enzymatic and antimicrobial activities. Three strains were selected because of their remarkable combination of traits: two S. uvarum isolated from different environment (one from A. araucana and one from apple chicha) and one S. eubayanus (from A. araucana). Initially, hybrids between the two S. uvarum strains and one S. cerevisiae wine strain were generated (S. cerevisiae x S. uvarum) at two temperatures (13°C and 20°C) using the rare-mating methodology. Hybrids were successfully generated at the two temperatures and crosses evaluated. Differences were observed in kinetic parameters and total fermentation time during the genetic stabilization processes. However, no significant differences were observed in white wines obtained with Sauvignon blanc must using these hybrids, neither in main physicochemical characteristics nor in aromatic profiles. However, these wines were different from those obtained with the parental strains. Young wines produced with the hybrids evidenced high concentrations of 1-propanol and malic acid, while fermentation products generated with S. cerevisiae showed elevated ethanol, 1-hexanol, hexyl, isoamyl and isobutyl acetate, ethyl octanoate and butirate concentrations. In the case of wines produced with S. uvarum parents, high concentrations of glycerol, shykimic acid and 2- phenylethanol were observed. In base of the obtained results, a new hybrid was generated with the selected S. eubayanus strain and the same S. cerevisiae (S. cerevisiae x S. eubayanus) at 20°C using the same methodology. This new hybrid strains, one S. cerevisiae x S. uvarum hybrid obtained previously as well as their respective parents were used as starter cultures for conducting pilot scale fermentations in Sauvignon blanc must, without sterilization, at 13°C. All the fermentation processes were successfully finished although implantation percentages, evaluated through molecular methods, and total time required for completing the processes were different. Both sensorial and aromatic analyses evidenced significant differences among the obtained wines. Consumer iv preferences showed that the wines obtained with the S. cerevisiae x S. eubayanus hybrid was preferred in comparison with those produced with the parental strains. Preferences among wines obtained with the S. cerevisiae x S. uvarum hybrid and their parents were similar, although all consumers noted that all wines were different. The analysis of tolerance to winemaking stress factors showed that S. eubayanus and S. cerevisiae were less affected by increasing concentrations of glucose and ethanol, while hybrids presented a higher growth range at different temperatures. At the same time, assays in synthetic must with high fructose and ethanol content, mimicking stuck fermentations, demonstrated advantages of hybrids in comparison with parental strains, particularly al low temperatures. The hybrids showed intermediate nitrogen requirement in synthetic must. Nitrogen requirements were additionally evaluated in other strains of S. uvarum and S. eubayanus by means of microplate assays, individual fermentations and competitions with S. cerevisiae at different temperatures. Results evidenced the existence of strains with low nitrogen requirement, able to successfully compete with S. cerevisiae, which could be used as parents for the development of new hybrids to be used in musts with poor nitrogen content. This work brings evidence of the physiological diversity of cryotolerant native strains from Patagonia and interspecific hybrids generated with them. In all cases, young white wines with different organoleptic characteristics and good consumer acceptance were achieved using the selected yeast strains.Fil: Origone, Andrea Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Patagonia Norte. Instituto de Investigación y Desarrollo en Ingeniería de Procesos, Biotecnología y Energías Alternativas. Universidad Nacional del Comahue. Instituto de Investigación y Desarrollo en Ingeniería de Procesos, Biotecnología y Energías Alternativas; Argentin