Azido IR-probes : a novel way to study phytochromes

Fytokromit ovat kasveista, sienistä ja bakteereista löytyvien valoa aistivien proteiinien perhe, jotka toiminnallaan säätelevät näiden organismien kasvua ja kehitystä. Fytokromeilla on kaksi palautuvaa rakenteellista konformaatiota, punaista valoa absorboiva Pr ja kaukopunaista valoa absorboiva Pfr. Valosignaalin aiheuttama isomerisaatio proteiinin sisään hautautuneessa bilin-kromoforissa laukaisee konformaation muutoksen tilasta toiseen, mutta näiden suuren kokoluokan rakenteellisten muutosten havainnointi liuoksessa tai reaaliajassa on haastavaa. Tässä tutkimuksessa liitimme geneettisesti värähtelijäleiman, epäluonnollisen aminohapon p-atsidofenyylialaniinin (pAzF), yhdeksään keskeiseen paikkaan Deinococcus radiodurans bakteerifytokromissa (DrBphP). Leima on ihanteellinen hyödynnettäväksi Fourier-muunnosinfrapuna (FTIR) spektroskooppisessa analyysissa, sillä atsido-ryhmän (–N3) asymmetriset värähdykset sijaitsevat proteiinin IR-spektrin signaalittomalla taajuudella. Ympäröivän sähkökentän ja vetysitoutumisen herkästi aistivan leiman avulla voidaan siksi havaita paikallisia kemiallisia ja rakenteellisia muutoksia Pr- ja Pfr-tilojen välillä. Leiman taajuuden siirtymä paljasti selvästi havaittavia muutoksia neljän paikan lähiympäristössä. Odotettu muutos havainnollistettiin rakenteellisesti joustavassa hiuspinniulokkeessa sijaitsevassa Y472, missä leima siirtyi vahvoja vetysidoksia muodostavasta ympäristöstä eli liuottimesta Pr-tilassa heikkoja tai ei ollenkaan vetysidoksia muodostavaan ympäristöön, eli kohti proteiinia, Pfr:ssä. Samanlainen, melko radikaali muutos havaittiin lähellä isomerisoituvaa biliverdiinin D-rengasta paikassa Y176, minkä perusteella leiman vetysidospari voisi olla proteiinin sisäinen vesimolekyyli. Hiuspinniä kohti osoittavassa F203:ssa leima aisti ulokkeen uudelleen laskostumisen Pr- ja Pfr-tilojen välissä ja raportoi luultavasti hydrofobisesta ympäristöstä -heliksin vieressä Pfr:ssä. Kauempana biliverdiinistä ja hiuspinniulokkeesta sijaitsevassa R228 leiman ympäristössä havaittiin ainoastaan pienestä muutoksesta, jonka havaittujen taajuuksien ja paikan perusteella arvioitiin raportoivan jatkuvasta liuottimelle altistumisesta. FTIR- ja UV-Vis -spektroskopia paljastivat, että kaikissa yhdeksässä paikassa leima vaikutti fytokromin absorptio-ominaisuuksiin jonkin verran. Kuitenkin ainoastaan kolmessa paikassa leima häiritsi selvästi proteiinin laskostumista tai valomuutosominaisuuksia, mikä havaittiin pienenä puhdistussaantona tai poikkeavina UV-Vis absorptiospektreinä. Onnistuneesti liitettyjen leimojen todellinen vahvuus piilee niiden potentiaalissa paljastaa signaalin eteneminen reaaliajassa aikaerotteisen FTIR-spektroskopian avulla ja siten ratkaista valosignaloinnin mysteeri bakteerifytokromissa.Phytochromes are a family of photosensory proteins found in plants, fungi and bacteria, which function to support the growth and development of these organisms. Phytochromes populate two reversible structural conformations: red light absorbing Pr and far-red light absorbing Pfr. A photosignal causes the isomerization of the bilin chromophore buried inside the protein, which triggers the conversion from one state to the other, but site-specific observation of these large-scale changes in solution or in real time is challenging. In this study, a vibrational probe, an unnatural amino acid p-azidophenylalanine (pAzF), was genetically incorporated into nine key positions of the Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome (DrBphP). This probe is ideal for Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy analysis as the asymmetric vibrations of the azide group (–N3) locate in signal-free region of the protein IR spectrum. Furthermore, the probe is sensitive to its local electric environment, especially the H-bonding strength, and therefore allows the detection of site-specific structural changes between Pr and Pfr. In four positions, the frequency shift revealed clearly detectable changes in the local environment. The expected change in the structurally flexible hairpin extension was demonstrated in position Y472 where the probe moved from strongly H-bonding environment in Pr, i.e. solvent, to non- or weakly H-bonding environment in Pfr, i.e. toward the protein. Similar, quite extreme but opposite change in the local environment of the label was observed in Y176 near the biliverdin isomerizing D-ring, which suggested that the H-bonding partner of the label in Pfr is an intramolecular water molecule. In position F203 that points towards the hairpin extension, the label sensed the refolding of the extension between Pr and Pfr and reported probably on a hydrophobic environment next to the -helix in Pfr. Further from the D-ring and the hairpin, the label in R228 revealed a minor change, which, based on the observed frequencies and the position, was addressed to a continuous solvent exposure of the residue. FTIR and UV-Vis spectroscopy indicated that the label affected the DrBphP absorption properties to a certain degree in all nine positions, but only in three positions it severely impeded the protein folding or photoswitchability revealed by a low purification yield or aberrant UV-Vis absorption spectra. The true power of the successfully incorporated probes lies in their potential to reveal the signal propagation in real time by using time-resolved FTIR and, in this way, unveiling the mystery of the signal transduction in bacteriophytochromes