Os efeitos bioestimulatórios dos agentes crosslinkers ricos em proantocianidinas e da alga Lithothamnium calcareum sobre células da polpa

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2018.Este estudo teve como objetivo avaliar in vitro a citotoxicidade direta e o potencial dentinogênico dos agentes crosslinkers ricos em proantocianidinas (extrato da semente da uva e ácido tânico) e do cimento obtido a partir do extrato da alga Lithothamnium calcareum sobre cultura primária de células pulpares humanas. Células pulpares foram obtidas a partir de terceiros molares de adultos com idades entre 18 e 30 anos. Culturas primárias foram estabelecidas e cultivadas até a obtenção do número adequado de células. Os agentes crosslinkers e remineralizantes foram diluídos previamente ao início de cada experimento. Extrato da semente da uva (GSE) e ácido tânico (TA) foram dissolvidos em água obtendo duas concentrações (0,65% e 0,0065%) e avaliados nos períodos 1 hora, 7, 14 e 21 dias para os testes de metiltetrazolium (MTT) e análise da produção de óxido nítrico (NO). Alga e hidróxido de cálcio, juntamente com o solvente dimetilsulfóxido (DMSO) nas concentrações de 0,2% e 0,02%, nos tempos imediato e 24 horas, foram avaliados utilizando os mesmos testes. Após 21 dias de diferenciação osteogênica, foram realizadas as análises de proteína total (PT), fosfatase alcalina (FA) e Alizarin Red para GSE/DMSO a 0,65% e 0,0065%. Para compor a análise de citotoxicidade, a viabilidade celular foi avaliada por meio do teste de produção de desidrogenase succínica e o estresse oxidativo foi avaliado por meio do ensaio de óxido nítrico. Para avaliar o potencial dentinogênico, as análises de proteína total (PT), fosfatase alcalina (FA) e formação de nódulos de mineralização foram realizadas após 21 dias de contato com os extratos. Coloração pelo brometo de etídio/laranja de acridina foi realizado para ilustrar os efeitos dos agentes crosslinkers (GSE e TA) sobre as células da polpa. Os resultados foram avaliados por testes não paramétricos (Kruskall-Wallis e Mann-Whitney; α=0,05). De acordo com os dados obtidos, foi possível observar que na análise de viabilidade celular para os agentes crosslinkers, houve um comportamento dependente da concentração utilizada, porém não de forma linear. A menor concentração de extrato de uva testada (0,0065%) apresentou resultados favoráveis tanto para a viabilidade celular em todos os períodos analisados, quanto a produção de NO, não havendo diferença significante do controle negativo para todos os tempos. Os agentes remineralizantes foram capazes de aumentar a viabilidade celular após 1 horas de contato, sendo que apenas o grupo do hidróxido cálcio 0,2% diferiu significativamente dos demais. Não houve diferença significante entre os grupos para a produção de óxido nítrico. O GSE e TA não diferiram do grupo controle quanto a produção de proteína total e fosfatase alcalina. Foram capazes de produzir nódulos de mineralização porém sem diferença estatisticamente significante do controle positivo. Os agentes crosslinkers e remineralizantes apresentam efeitos biológicos sobre as células da polpa.Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF).This study aimed to evaluate in vitro the direct cytotoxicity and dentinogenic potential of crosslinker agents which are rich in proanthocyanidin (grape seed extract and tanic acid) and the cement obtained from the extract of the algae Lithothamnium calcareum on primary culture of human pulp cells. Pulp cells were obtained from third molars of adults between the ages 18 and 30 years. Primary cultures were established and cultured until adequate numbers of cells were obtained. The crosslinkers and remineralizing agents were diluted prior to the beginning of each experiment. Grape seed extract (GSE) and tanic acid (TA) were dissolved in water obtaining two concentrations (0.65% and 0.0065%) and evaluated them in the periods 1 hour, 7, 14 and 21 days for the methyltetrazolium test (MTT) and analysis of the production of nitric oxide (NO). Algae and calcium hydroxide together with DMSO at concentrations of 0.2% and 0.02%, at the immediate times and 24 hours, were evaluated using the same tests. After 21 days of osteogenic differentiation, the analyzes of total protein (PT), alkaline phosphatase (FA) and Alizarin Red for GSE/DMSO were carry out at 0.65% and 0.0065%. To compose the cytotoxicity analysis, cell viability was evaluated by means of the succinic dehydrogenase production test and oxidative stress was evaluated by the nitric oxide assay. To evaluate the dentinogenic potential, total protein (PT), alkaline phosphatase (FA) and mineralization nodule formation were executed after 21 days of contact with the extracts. Ethidium bromide/acridine orange staining was performed to illustrate the effects of crosslinking agents (GSE and TA) on pulp cells. The results were evaluated by non-parametric tests (Kruskall-Wallis and Mann-Whitney; α = 0.05). According to the data obtained, it was possible to observe that in the cellular viability analysis for the crosslinkers agents, there was a behavior dependent of the concentration used, but not in a linear way. The lowest concentration of grape extract tested (0.0065%) presented favorable results for both cell viability in all analyzed periods, as well as NO production, with no significant difference of the negative control for all times. The remineralizing agents were able to increase cell viability after 1 hour of contact, and only the 0.2% calcium hydroxide group differed significantly from the others. There was no significant difference between groups for the production of nitric oxide. GSE and TA did not differ from the control group for total protein and alkaline phosphatase production. They were able to produce mineralization nodules but with no statistically significant difference of the positive control. The crosslinkers and remineralizing agents have biological effects on pulp cells