Biochemical and biophysical characterization of a β-glucosidase obtained from Syntermes wheeleri gut metagenome

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2019.As celulases são enzimas da família Glicosil hidrolases (GHs) que estão envolvidas na degradação da celulose e participam em diversas aplicações biotecnológicas. Neste estudo foram selecionadas sequências metagenômicas do intestino de Syntermes wheeleri, um cupim endêmico do Cerrado brasileiro, para seleção, purificação e caracterização de uma celulase. Entre as sequências selecionadas e produzidas em Escherichia coli (DE3) foi escolhida apenas uma para o trabalho, uma β-glicosidase GH3 (β-G 72-26) que apresentou melhor produção em relação às outras (β-1,4-endoglucanase e exoglucanase). A β-G 72-26 foi purificada por cromatografia de exclusão molecular, apresentando tamanho aproximado de 89,7 KDa em gel SDS-PAGE 12%. A enzima foi caracterizada quanto ao pH e temperatura ótimo, quando pode-se observar duas faixas de pH ótimo, pH 7,0 e 10,0, e uma temperatura ótima de 40 ºC. Por meio dos parâmetros cinéticos pode-se constatar melhor atividade enzimática em pH básico, contudo melhor afinidade (Km) pelo substrato pNPG em pH neutro. Além disso, em pH neutro a β-G 72-26 apresentou melhor eficiência catalítica (Kcat/Km). Os resultados de dicroísmo circular mostraram que a estrutura secundária da enzima é dependente de pH, com porcentagens diferentes de estruturas alfa hélice e folhas beta, apresentando-se mais estruturada em pH 10,0. Já nos resultados de termoestabilidade pode-se observar a desnaturação da β-G 72-26 em ambos os pHs, menos em pH ácido (4,0). Ainda como análise estrutural, a β-glicosidase em estudo foi alinhada com sequências estruturadas do PDB (Protein Data Bank) para análises de domínios e sítios catalíticos conservados, quando constatou-se a presença de 3 domínios: (1) (α/β)8-barril (TIM barril), (2) (α/β)6 folha (β-sanduíche) e (3) Fibronectina iii, com função ainda desconhecida. Os sítios catalíticos conservados foram os Asp233 e Glu417. Por meio dos resultados obtidos a β-G 72-26 mostra-se uma candidata a ensaios de aplicação industrial, além de contribuir para a caracterização de uma nova β-glicosidase GH3, a qual pertence a um cupim endêmico no Cerrado brasileiro.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Cellulases are enzymes of the family Glycoside Hydrolases (GHs) that are involved in the degradation of cellulose and participate in several biotechnological applications. In this study were selected metagenomic sequences of Syntermes wheeleri gut, an endemic termite from the Brazilian Cerrado, for selection, purification and characterization of a cellulase. Among the sequences selected and produced in Escherichia coli (DE3), only one was chosen for the work, a β-glucosidase GH3 (β-G 72-26) which presented better production than the others (β-1,4-endoglucanase and exoglucanase). β-G 72-26 was purified by size exclusion chromatography, having approximate size of 89.7 KDa on 12% SDS-PAGE gel. The enzyme was characterized in terms of pH and optimum temperature, when two ranges of optimum pH, pH 7.0 and 10.0, and an optimum temperature of 40 ºC were observed. By means of the kinetic parameters were observe better enzymatic activity at basic pH, but better affinity (Km) for the pNPG substrate at neutral pH. Furthermore, at neutral pH the β-G 72-26 showed better catalytic efficiency (Kcat / Km). The results of circular dichroism showed that the secondary structure of the enzyme is pH-dependent, with different percentages of alpha helix structures and beta sheets, being more structured at pH 10.0. In the results of thermostability were detected the denaturation of β-G 72-26 in both pHs, less in acid pH (4.0). As a structural analysis, the β-glucosidase in the study was aligned with structured sequences of PDB (Protein Data Bank) for analyzes of conserved domains and catalytic sites, when the presence of 3 domains was verified: (1) (α / β) 8-barrel (TIM barrel), (2) (α / β) 6 sheet (β-sandwich) and (3) Fibronectin III, with function not yet known. The conserved catalytic sites were Asp233 and Glu417. By means of the results obtained β-G 72-26 is a candidate for industrial applications, besides contributing to the characterization of a new β-Glucosidase GH3, which belongs to an endemic termite in the Brazilian Cerrado