Potencial de transfecção de células tronco mesenquimais bovinas

Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2018.Células de diferentes origens comportam-se de maneira distinta quanto à incorporação de um material genético exógeno e formação de uma célula transgênica. Tendo isto em vista, diferentes protocolos de transfecção foram testados e comparados para células mesenquimais de duas origens distintas: da geleia de Wharton (CMGW), do tecido adiposo (CMADP) e fibroblastos (FIB). O anti-CD3 humanizado é um anticorpo monoclonal que interage com a molécula CD3 do receptor da célula T levando à supressão das células T, tendo em vista que esta região é responsável pela ativação destas células. Por este motivo, este anticorpo é considerado uma opção no tratamento de doenças autoimunes e pós transplantes de órgãos. Sabendo do seu potencial para a saúde pública e pensando em formas de otimizar a produção do anti-CD3 humanizado ele foi utilizado neste trabalho para a produção de células transgênicas que, no futuro, poderão ser utilizadas na elaboração de animais biorreatores produtores desta proteína recombinante por meio de transferência nuclear. Neste projeto, a técnica de transfecção foi aplicada utilizando os kits de transfecção: lipofectamine® LTX com reagente PLUS™ e Xfect™. Após o tratamento, as células foram submetidas a análises de microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e reação em cadeia de polimerase (PCR). As células mesenquimais da geleia de Wharton mostraram-se sensíveis aos tratamentos e entraram no estágio de morte celular. Na citometria de fluxo, a mediana da fluorescência foi superior para as CMADP em relação aos FIB, tanto para o reagente XFECT (20.057 ± 1.620,7 e 10.601 ± 702,86, respectivamente. p < 0,05) quanto para o LTX (19.590 ± 113,84 e 10.518 ± 442,65 respectivamente. p < 0,05). Estes resultados, associados à avaliação de epifluorescência, demonstraram que as CMADP apresentam uma melhor resposta à transfecção quando comparadas aos FIB, independente do kit utilizado. Além disso, a PCR realizada com as células mesenquimais do tecido adiposo e com os fibroblastos co-transfectados comprovou a presença do DNA de interesse em todas as amostras, viabilizando esta abordagem em experimentos futuros.Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF); Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Cells from different origins behave differently regarding the incorporation of an exogenous genetic material and the formation of a transgenic cell. Taking that into consideration, different transfection protocols were tested and compared to mesenchymal cells of two distinct origins: Wharton's jelly (CMGW), adipose tissue (CMADP) and fibroblasts (FIB). Humanized anti-CD3 is a monoclonal antibody that reacts with the CD3 molecule of the T cell receptor leading to suppression of the T cells, since this region is responsible for the activation these cells. For this reason, this antibody is considered as an option in the treatment of autoimmune diseases and after organ transplants to avoid rejection. Knowing the potential of this monoclonal antibody for public health and thinking of ways to optimize the production of the humanized anti-CD3, it was used in this experiment to produce transgenic cells that, in the future, could be used in the production of transgenic animal bioreactors, which expresses this recombinant protein, by nuclear transfer. In this study, the transfection technique was applied using the transfection kits: lipofectamine® LTX with PLUS™ reagent and Xfect™. After the treatment the cells were submitted to fluorescence microscopy, flow cytometry and polymerase chain reaction (PCR) analyzes. Wharton’s jelly mesenchymal cells were sensitive to the treatments and entered in the cell death stage. In the flow cytometry, the fluorescence median was higher for the CMADP in relation to the FIB, for both Xfect reagent (20,057 ± 1,620.7 and 10,601 ± 702.86, respectively, p < 0.05) and for the LTX (19,590 ± 113.84 and 10,518 ± 442.65 respectively, p < 0.05). These results, associated with the evaluation of epifluorescence, demonstrated that the CMADP present a better response to transfection when compared to the FIB, regardless of the kit used. In addition, the PCR performed with co-transfected mesenchymal cells of the adipose tissue and fibroblasts confirmed the presence of the DNA of interest in all samples, making this approach feasible in future experiments