Avaliação do efeito das Ocelatinas-PT (1 a 8) em cultivos de Leishmania e macrófagos : perspectiva na identificação de novos compostos leishmanicidas

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2019.A leishmaniose ameaça atualmente 350 milhões de pessoas em 98 países ao redor do mundo e estima-se que existam 12 milhões de pessoas infectadas no mundo. O Tratamento baseia-se nos compostos antimoniais, que são um dos principais medicamentos, que apesar de eficazes apresentam toxicidade e podem provocar resistência nas leishmânias. Assim, a busca por novos compostos eficazes e de baixa toxicidade impulsiona as pesquisas. Os peptídeos antimicrobianos como as ocelatinas-PT apresentam potencial terapêutico devido a sua capacidade de interagir com as membranas das células de mamíferos causando pouco ou nenhum dano a elas e resultando em um processo de permeabilização e rompimento da membrana do micro-organismo. Por ser um princípio ativo novo faz-se necessário identificar seu efeito in vitro para viabilizar sua aplicação biomédica. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito das ocelatinas-PT de 1 a 8 em cultivos de Leishmania sp. para determinar pelo índice de seletividade (IS) compostos com potencial leishmanicida e avaliar o efeito das ocelatinas selecionadas na em cultivos amastigotas de L. amazonensis e de macrófagos J774, infectados e não infectados. Para tal, Leishmania infantum e Leishmania amazonensis foram incubadas com diferentes concentrações de Ocelatinas-PT para determinar a concentração inibitória. Os macrófagos derivados de medula óssea e células J774.A1 foram incubadas com as ocelatinas-PT (1 a 8) para a determinação da concentração citotóxica e do IS. Depois, macrófagos J774 foram infectados com formas amastigotas de L. amazonensis para determinar pelo índice de infecção/microscopia óptica e por qPCR o efeito microbicida; por citometria de fluxo a produção de espécies reativas de oxigênio e de corpúsculos lipídicos e pelo método de Greiss a produção de óxido nítrico. Os resultados mostraram que: as ocelatinas-PT de 1 a 8 inibiram 50% as formas promastigotas de L. infantum e apresentaram baixa toxicidade em cultivos de macrófagos medulares e J774; as ocelatinas PT1 e PT8 causaram aumento de rugosidade, bolhas, erupções vesiculares e caveolares nas membranas de L. infantum; as ocelatinas PT4 e PT6 inibiram 50% das formas amastigotas de L. infantum, inibiram as formas amastigotas de L. amazonensis e apresentaram baixa toxicidade em cultivos de macrófagos J774 (CC50 >512 μg/mL), reduziram de forma dose-dependente a infecção dos macrófagos J774 com L. amazonensis; reduziram a aderência celular com todas as concentrações, mas não de forma dose-dependente, aumentaram a produção de EROs, ON e o índice corpuscular por macrófagos infectados. No conjunto, os resultados demonstram o potencial leishmanicida e imunomodulador das ocelatinas-PT4 e PT6 para futuros ensaios in vivo visando a compreender seu efeito sistêmico e seu mecanismo de ação.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Leishmaniasis currently threatens 350 million people in 98 countries around the world and it is estimated that 12 million people are infected in the world. The treatment is based on antimonial compounds which is effective but toxic and may cause resistance in leishmaniasis. Thus, the search for new and effective compounds of low toxicity are crucial. Antimicrobial peptides, such as ocellatins-PT, present therapeutic potential due to their ability of interaction causing low or no damage to the mammal’s membranes cells and resulting in a process of permeabilization and rupture of the microorganism membrane. Because it is a new active principle, it is necessary to identify it’s in vitro effect to enable its biomedical application. The objective of this study was to evaluate the effect of ocellatins-PT 1 to 8 on Leishmania sp in order to obtain the selectivity index (IS) of the compound with leishmanicide potential to evaluate the effect of the Ocellatins selected on cultures with L. amazonensis amastigote and J774 macrophages, uninfected and infected. For this, Leishmania infantum and Leishmania amazonensis were incubated with different concentrations of Ocellatins-PT to determine an inhibitory concentration. Bone marrow-derived macrophages and J774.A1 cells were incubated with ocellatins-PT (1 to 8) for the determination of cytotoxic activity and SI. Afterwards, macrophages were infected with amastigote forms of L. amazonensis to obtain the infection index / optical microscopy; by qPCR of microbicidal effect; by flow cytometry the production of reactive species of oxygen and lipid bodies and by the method of Greiss to evaluate the nitric oxide production. The results were as follows: the ocellatins-PT from 1 to 8 showed inhibited as 50% forms promastigotes of L. infantum and low toxicity in the culture of medullary macrophages and J774; the ocellatins-PT1 and PT8 caused increase of roughness, bubbles, vesicular eruptions and cavities in the membranes of L. infantum; ocellatins PT4 and PT6 inhibited 50% of the amastigote forms of L. infantum, inhibited as amastigote forms of L. amazonensis and showed low toxicity in cultures of macrophages J774 (CC50> 512 μg/mL); reduced dose-dependent infection of J774 macrophages with L. amazonensis; there was a reduced cell adhesion at all concentrations, but not in a dose-dependent manner, increased ROS production, ON and corpuscular index by infected macrophages. Together, the results demonstrate the leishmanicidal and immunomodulatory potential of PT4 and PT6 ocelatins for future in vivo assays in order to understand their systemic effect and mechanism of action