Crystal structures and biophysical studies of phytocystatins

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.Fitocistatinas são inibidores de cisteíno-proteases encontrados em plantas, onde participam de vários processos fisiológicos, dos quais se destacam a deposição de proteínas de armazenamento, germinação de sementes e senescência de folhas. A expressão de fitocistatinas em plantas tem um papel importante na tolerância a fatores de estresse abióticos e resistência a herbivoria por insetos, o que torna essas proteínas valiosos alvos de estudo, devido a aplicações biotecnológicas no melhoramento de culturas. Neste trabalho, técnicas biofísicas foram empregadas para caracterizar fitocistatinas de organismos economicamente relevantes, como Hevea brasiliensis (seringueira), Theobroma cacao (cacaueiro), Humulus lupulus (lúpulo) e Cannabis sativa (cannabis). As proteínas foram obtidas por expressão heteróloga em E. coli Lemo21 (DE3), cultivadas em meio auto-indutor ZYM-5052, e purificadas por cromatografia de afinidade ao níquel (Ni2+) seguida de cromatografia de exclusão molecular S-75. A estabilidade térmica foi monitorada por dicroísmo circular em ensaios de desnaturação térmica em diferentes pHs, e a oligomerização das proteínas foi estudada por ultracentrifugação analítica. Screenings de cristalização das proteínas foram realizados com o robô mosquito®, as condições de cristalização foram refinadas manualmente e os cristais foram submetidos à coleta de dados de difração de raios-X no LNLS. Ensaios de desnaturação térmica mostraram que as proteínas apresentam elevadas temperaturas de desdobramento (Tm), indo de 61 °C a 84 °C, e ΔG25’s resultantes do desdobramento acima de 4 kcal/mol em todos os pHs estudados, indicando estabilidade térmica de moderada a alta. Nas condições experimentais (20°C e pH 7,6), conformações diméricas da maioria das proteínas foram favorecidas, embora monômeros e tetrâmeros também tenham sido observados. A estrutura cristalina de uma fitocistatina do lúpulo foi resolvida a partir de cristais dos grupos espaciais ortorrômbicos P 2 21 21 e C 2 2 21 a resoluções máximas de 1,80 Å e 1,68 Å, respectivamente, e a estrutura cristalina de uma fitocistatina da cannabis foi resolvida a 3,6 Å a partir de um cristal do grupo espacial hexagonal P 65 2 2. As três estruturas apresentaram dímeros domain-swapped, onde a principal diferença em relação à estrutura de fitocistatina de maior identidade depositada no PDB são o ângulo e a distância entre os lobos do dímero.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).Phytocystatins are cysteine-protease inhibitors found in plants, in which they take part in various physiological processes such as storage protein deposition, seed germination and leaf senescence. The expression of phytocystatins in plants has an important role in abiotic stress tolerance and resistance to herbivory by insects, which makes such proteins valuable study targets due to biotechnological applications in culture improvement. In this work, biophysical techniques were employed to characterize phytocystatins from organisms of economic relevance, like Hevea brasiliensis (rubber tree), Theobroma cacao (cocoa tree), Humulus lupulus (hop) and Cannabis sativa (cannabis). The proteins were obtained through heterologous expression in E. coli Lemo21 (DE3), cultivated in auto-inducing medium ZYM-5052, and purified by immobilized Ni2+ ion affinity chromatography followed by size exclusion chromatography S-75. Thermal stability was monitored by circular dichroism measurements in unfolding assays at different pHs, and protein oligomerization was studied by analytical ultracentrifugation. Protein crystallization screenings were performed with the mosquito® robot and the crystallization conditions were manually refined prior to sending the crystals for the collection of X-ray diffraction data at LNLS. Thermal denaturation assays showed that the proteins exhibited high melting temperatures ranging from 61 °C to 84 °C and unfolding ΔG25’s higher than 4 kcal/mol in the studied pHs, indicating moderate to high thermal stability. In the experimental conditions (20 °C and pH 7.6), dimeric conformations of most of the proteins seemed to be favored, though monomers and tetramers were also observed. The crystal structure of a phytocystatin from hop was solved from crystals of orthorhombic space groups P 2 21 21 and C 2 2 21 at maximum resolutions of 1.80 Å and 1.68 Å, respectively, and the crystal structure of a cannabis phytocystatin was solved at a 3.6 Å resolution from a hexagonal P 65 2 2 space group crystal. The three structures presented domain swapped dimers, where the main differences to the phytocystatin structure with the highest identity deposited in the PDB are the angle and the distance between the lobes of the dimers