Quorum sensing Rezeptorprotein LuxP – gentechnisches Design von LuxP-Derivaten zur Anwendung in der Biosensorik

Als Quorum sensing (QS) wird die Kommunikation zwischen Bakterien bezeichnet. Diese basiert auf kleinen Signalmolekülen, die Autoinducer (AI) genannt werden. Durch QS werden von Bakterien Verhaltensweisen wie Fähigkeit zur Symbiose, Virulenz, Produktion von Antibiotika und Bildung von Biofilmen reguliert. Die Kommunikation kann innerhalb einer Spezies (Intraspezies-Kommunikation) oder mehreren Spezies (Interspezies-Kommunikation) erfolgen. Gram-negative Bakterien kommunizieren über acetylierte Homoserinlaktone (AHL), Gram-positive Bakterien dagegen benutzen modifizierte Oligopeptide als Autoinducer. Für die Interspezies-Kommunikation dient der Autoinducer-2 (AI-2). AI-2 entsteht auf dem Weg der spontanen Zyklisierung von 4,5-Dihydroxy-2,3-Pentadion (DPD), der von LuxS synthetisiert wird. Die Universalität des AI-2 als Signalmoleküls basiert auf dessen chemischen Eigenschaften. Als biologisch aktive Formen von DPD gelten S-THMF-Borat (bei marinen Bakterien wie Vibrio harveyi) und R-THMF (z.B. bei Enterobakterien wie Escherichia coli oder Salmonella enterica Serovar Typhimurium). AI-2 wird bei allen Bakterien von einem periplasmatischen Rezeptor gebunden. S-THMF-Borat bindet spezifisch an den Rezeptor LuxP, R-THMF dagegen an den Rezeptor LsrR. Durch die Anbindung des AI-2 verändert sich die Konformation des Rezeptors, was als Signal über weitere Proteine in die Zelle weitergeleitet wird. In E. coli ist die Expression des Operons lsrACDBFGE von AI-2 abhängig. Der lsr-Promotor wird von dem Repressor LuxR, Phospo-AI-2 sowie dem cAMP-CRP-Komplex reguliert. In dieser Arbeit wurden die molekularbiologische Grundlagen zur Entwicklung eines AI-2-Biosensors gelegt. Es wurden mehrere Fusionskonstrukte des V. harveyi AI-2 Rezeptors LuxP sowie dessen Derivate mit veränderter Affinität zur AI-2 kreiert, in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Auch Rezeptorproteine von Vibrio fischeri sowie E. coli konnten erfolgreich exprimiert werden. Die Expression der Proteine erfolgte in E. coli luxS- Deletionsstämmen, die hierfür konstruiert worden sind. Die AI-2-Rezeptorproteine werden in E. coli vorwiegend in Form von inclusion bodys exprimiert. Nur ein Teil des Proteins ist löslich und kann für die Aufreinigung unter nativen Bedingungen verwendet werden. Auf der Basis von E. coli luxS- Deletionsstämmen wurde ein Bioassay entwickelt, der für die Detektion von AI-2 verwendet werden kann. Hierfür wurden mehrere Reporterplasmide konstruiert, in denen das rot fluoreszierende Protein DsRed unter die Kontrolle des lsr-Promotors von E. coli kloniert wurden. Dabei konnte unter Verwendung einer dieser Reporterplasmide (pBRDsRed) sowie des luxS-Deletionsstammes KIB1 Bioassay-Bedingungen etabliert werden, die einen Nachweis von AI-2 ermöglichen. Die für den Assay benötigten AI-2-Moleküle wurden in vitro mithilfe der Enzyme Pfs und LuxS und S-Adenosyl-Homocystein (SAH) als Substrat hergestellt. Der entwickelte AI-2-Bioassay wurde für die Bestimmung der Bindeaktivität der V. harveyi LuxP-Derivate verwendet. Die resultierenden Ergebnisse wiesen eine hohe Reproduzierbarkeit (1,2 bis 11,3 % Standartabweichung) auf