Untersuchung der transkriptionellen Regulation von Kandidatengenen der Pathogenabwehr gegen Plasmopara viticola in der Weinrebe

Differentielle Genexpressionsstudien für einen resistenten und einen anfälligen Genotyp haben gezeigt, dass zehn Stunden nach der Inokulation mit Erysiphe necator die Expression der Transkriptionsfaktoren CZF1/ZFAR1 und MYBB, der Ethylen-responsiven Faktoren ERF1 und ERF5, der PAL (Phenylalanine-ammonia Lyase), der Pathogen-related Proteine PR5 und PR10.1 und den WRKY-Transkriptionsfaktoren WRKY7, WRKY33 und WRKY57 verstärkt wird (Welter, 2008). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten die Promotoren der Gene ERF1, ERF5, MYBB, PAL, PR10.1 und WRKY7 für die resistente Rebsorte `Regent´ im Vergleich zur anfälligen Sorte `Lemberger´ erfolgreich amplifiziert und sequenziert werden. In den Promotorbereichen betrug die durchschnittliche SNP-Häufigkeit 1/39 und die Frequenz der Insertions-/Deletionsereignisse lag bei 1/210. Die in silico Analyse des PR10.1 Promotors zeigte außerdem, dass eine Bindestelle für den Repressor SEBF (silencing elemental binding factor) für beide Allele von `Lemberger´ und das „anfällige“ Allel A von `Regent´ existiert. Das Allel B der PR10.1 Promotors des Genotyps `Regent´ war eindeutig vom resistenten Elter `Chambourcin´ vererbt. Insgesamt wurden 13 WRKY-, vier ERF- und 22 MYB-Bindestellen im PR10.1 Promotor identifiziert. Der anschließende duale Luciferaseassay zeigte, dass die Transkription von PR10.1 positiv durch die Transkripitonsfaktoren CZF1/ZFAR1, ERF5 und WRKY33 reguliert wird. Es wurden differentielle Genexpressionsstudien mit in vitro Reben von `Regent´ (resistent gegen E. necator und Plasmopara viticola) und `Lemberger´ (anfällig gegen E. necator und P. viticola) für die Zeitpunkte 0, 1, 2, 4, 6, und 24 Stunden nach der Inokulation mit P. viticola durchgeführt. Die Studien zeigten, dass die Transkriptionsfaktoren ERF5 und WRKY33 bereits eine Stunde nach der Inokulation bei dem resistenten Genotyp in ihrer Expression verstärkt wurden. Die Expression von WRKY33 war auch nach zwei Stunden noch induziert. Sechs Stunden nach der Inokulation wurde PR10.1 7,6-fach in der Expression bei `Regent´, aber nicht bei `Lemberger´ verstärkt transkribiert. Eine Applikation von Salicylsäure 24 Stunden vor der Inokulation mit P. viticola führte dazu, dass die Genexpression komplett verändert wurde. Vier Stunden nach der Inokulation wurden die NBS-LRR Gene VRP1-2, VRP1-3, NBS-LRR1 und NBS-LRR2 mindestens 13,4-fach für den resistenten Genotyp in der Expression verstärkt. VRP1-1 hingegen wurde nicht beeinflusst.Dies weist daraufhin, dass die Vorbehandlung mit Salicylsäure die Effektor-gesteuerte Immunantwort deutlich verstärkt, da die NBS-LRR Gene nach ihrer Annotation und angenommen Funktion Rezeptoren für die Effektoren darstellen. NBS-LRR1 und NBS-LRR2 wurden im Bereich des Rpv10-Locus identifiziert (Schwander et al., 2012). Differentielle Genexpressionsanalysen zeigten, dass die basale Expression von NBS-LRR1 und NBS-LRR2 bei Genotypen mit einem Rpv10-Locus fünffach höher ist als bei Genotypen mit einem Rpv3, Rpv12 oder alternativ gar keinem Resistenz-Locus. Dies ist ein Hinweis dafür, dass die beiden NBS-LRR Gene an der Ausprägung der Resistenz der Rpv10-Träger wesentlich beteiligt sein könnten.Differentielle Genexpressionsstudien für einen resistenten und einen anfälligen Genotyp haben gezeigt, dass zehn Stunden nach der Inokulation mit Erysiphe necator die Expression der Transkriptionsfaktoren CZF1/ZFAR1 und MYBB, der Ethylen-responsiven Faktoren ERF1 und ERF5, der PAL (Phenylalanine-ammonia Lyase), der Pathogen-related Proteine PR5 und PR10.1 und den WRKY-Transkriptionsfaktoren WRKY7, WRKY33 und WRKY57 verstärkt wird (Welter, 2008). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten die Promotoren der Gene ERF1, ERF5, MYBB, PAL, PR10.1 und WRKY7 für die resistente Rebsorte `Regent´ im Vergleich zur anfälligen Sorte `Lemberger´ erfolgreich amplifiziert und sequenziert werden. In den Promotorbereichen betrug die durchschnittliche SNP-Häufigkeit 1/39 und die Frequenz der Insertions-/Deletionsereignisse lag bei 1/210. Die in silico Analyse des PR10.1 Promotors zeigte außerdem, dass eine Bindestelle für den Repressor SEBF (silencing elemental binding factor) für beide Allele von `Lemberger´ und das „anfällige“ Allel A von `Regent´ existiert. Das Allel B der PR10.1 Promotors des Genotyps `Regent´ war eindeutig vom resistenten Elter `Chambourcin´ vererbt. Insgesamt wurden 13 WRKY-, vier ERF- und 22 MYB-Bindestellen im PR10.1 Promotor identifiziert. Der anschließende duale Luciferaseassay zeigte, dass die Transkription von PR10.1 positiv durch die Transkripitonsfaktoren CZF1/ZFAR1, ERF5 und WRKY33 reguliert wird. Es wurden differentielle Genexpressionsstudien mit in vitro Reben von `Regent´ (resistent gegen E. necator und Plasmopara viticola) und `Lemberger´ (anfällig gegen E. necator und P. viticola) für die Zeitpunkte 0, 1, 2, 4, 6, und 24 Stunden nach der Inokulation mit P. viticola durchgeführt. Die Studien zeigten, dass die Transkriptionsfaktoren ERF5 und WRKY33 bereits eine Stunde nach der Inokulation bei dem resistenten Genotyp in ihrer Expression verstärkt wurden. Die Expression von WRKY33 war auch nach zwei Stunden noch induziert. Sechs Stunden nach der Inokulation wurde PR10.1 7,6-fach in der Expression bei `Regent´, aber nicht bei `Lemberger´ verstärkt transkribiert. Eine Applikation von Salicylsäure 24 Stunden vor der Inokulation mit P. viticola führte dazu, dass die Genexpression komplett verändert wurde. Vier Stunden nach der Inokulation wurden die NBS-LRR Gene VRP1-2, VRP1-3, NBS-LRR1 und NBS-LRR2 mindestens 13,4-fach für den resistenten Genotyp in der Expression verstärkt. VRP1-1 hingegen wurde nicht beeinflusst.Dies weist daraufhin, dass die Vorbehandlung mit Salicylsäure die Effektor-gesteuerte Immunantwort deutlich verstärkt, da die NBS-LRR Gene nach ihrer Annotation und angenommen Funktion Rezeptoren für die Effektoren darstellen. NBS-LRR1 und NBS-LRR2 wurden im Bereich des Rpv10-Locus identifiziert (Schwander et al., 2012). Differentielle Genexpressionsanalysen zeigten, dass die basale Expression von NBS-LRR1 und NBS-LRR2 bei Genotypen mit einem Rpv10-Locus fünffach höher ist als bei Genotypen mit einem Rpv3, Rpv12 oder alternativ gar keinem Resistenz-Locus. Dies ist ein Hinweis dafür, dass die beiden NBS-LRR Gene an der Ausprägung der Resistenz der Rpv10-Träger wesentlich beteiligt sein könnten