Genetic study on the biological function of the antioxidant enzymes in Escherichia coli

好気性生物は増殖、生存に必要なエネルギーを得るために酸素を消費するが、代謝過程において一部の酸素は反応性が高い、生物にとって有害な活性酸素に変換されてしまう。それに対して生物は種々の酸化ストレス耐性機構を備えている。一般的に生物は多くの抗酸化酵素を持っており、特に活性酸素を分解する抗酸化酵素としてカタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、ペルオキシダーゼなどは重要である。大腸菌では２種類のカタラーゼ（KatE, KatG）、３種類のスーパーオキシドディスムターゼ（SodA, SodB, SodC）が同定されており、ペルオキシダーゼとしてはAhpCFが酸化ストレス耐性に重要であることが知られている。これらの活性酸素分解酵素群の生化学的な性質については、詳細に調べられているが、生体内での機能についてはまだよくわかっていないことも多い。そこで本研究ではこれらの遺伝子の変異が大腸菌の増殖、生存に及ぼす影響について調べた。まずこれらの酵素の遺伝子の欠失変異が増殖、生存に与える影響について、変異株とその親株を混合培養した後で、それぞれの菌株の割合の変化を見るCompetition assayにより調べた。その結果、培地にマンガンを加えて培養した場合、AhpCF欠損変異株の割合が親株より低下することがわかり、増殖期または定常期の初期においてAhpCFの機能が重要であることが示唆された。また同じく培地にマンガンを加えて長時間培養した時には、SodB欠損変異株の割合が低下することがわかり、定常期においてSodBの機能が重要であることも示唆された。定常期におけるSodBの機能については、定常期におけるSodBの発現量を増大させた時の生育を調べるために、定常期での発現量が多いdps遺伝子の上流領域をsodB遺伝子と融合させた菌株についてCompetition assayを行った。その結果マンガンおよび鉄を培地に加えて長時間培養した時に、dps遺伝子の上流領域をsodB, sodC遺伝子と融合させた菌株の割合が増大する傾向があることがわかり、この実験からも定常期におけるSodBの機能の重要性が示唆された。これまでにも酸化ストレスと鉄、マンガンなどの金属との関係は注目されてきたが、活性酸素分解酵素群の種々の変異株を用いることによって、これらの金属の有無を含めたいろいろな培養条件における、それぞれの活性酸素分解酵素の増殖、生存における機能を明らかにすることができると考えられる。Aerobic organisms uses oxygen to get energy necessary for cell growth and survival, but some oxygen is converted into reactive oxygen species (ROS) which is highly reactive in a metabolism process and harmful to the organism. Organisms have some types of oxidative stress-resistant system. Especially, antioxidant enzymes, catalase, superoxide dismutase and peroxidase, are particularly important. In Escherichia coli, two catalases (KatE, KatG), three superoxide dismutases (SodA, SodB, SodC), and one peroxidase (AhpCF) are important for oxidative stress resistance. These enzymes have been biochemically characterized in detail, but their biological function is not completely clarified. Therefore, I studied the function of the above six antioxidant enzymes in cell growth and survival.First, I investigated the effects of deletion mutations of the genes for these enzymes on cell growth and survival by Competition assay. After each of the mutant strains was mixed with the parental strain and incubated, I examined the change in the proportion of strains in the culture. When the cells were incubated for 24 hours in the presence of manganese, the proportion of the ahpCF deletion mutant decreased. And the proportion of the sodB deletion mutant decreased when the cells were incubated for 96 hours in the presence of manganese and iron. These results suggested that the function of AhpCF was important in the log or early stationary phase and that the function of SodB was important in the stationary phase.Next, I investigated the effects of increased expression level of SodB on the viability in the stationary phase by Competition assay using the strain, in which the promoter and ribosome binding regions of the sodB gene was replaced with those of the dps gene. The dps gene is highly expressed in the stationary phase. When the cells were incubated for 96 hours in the presence of manganese and iron, the proportion of the strain having both the modified sodB gene and the similarly modified sodC gene was somewhat increased. These results suggested that the functions of SodB and SodC are not only important but also rate-limiting factors in the stationary phase under that culture condition.The relationship between oxidative stress and metals such as iron and manganese has been reported so far. I will clarify the division of roles of the antioxidant enzymes in cell growth and survival under various conditions using the mutant and modified strains.首都大学東京, 2019-03-25, 修士（理学）首都大学東