Study of the evolution of the physiological state of L. lactis TOMSC161 during the fermentation and its impact on its resistance to freeze-drying and storage

Les ferments lactiques, d’une importance industrielle considérable, sont très largement commercialisés sous forme concentrée, congelée ou lyophilisée en vue de leur utilisation ultérieure dans les procédés industriels tels que les procédés de production de fromage. Cependant, les procédés de stabilisation (congélation et lyophilisation) engendrent différents stress qui peuvent conduire à de faibles taux de survie et des pertes de fonctionnalités des microorganismes. Dans ce contexte, ce travail de thèse vise à mieux comprendre l’incidence de l’état physiologique des cellules de L. lactis TOMSC161 au moment de la récolte sur leur tolérance à la lyophilisation et au stockage, et de développer des outils simples mais efficaces d’évaluation de l’état physiologique des cellules au cours de la fermentation pour les industriels. Dans une première partie, l’influence de différents paramètres de fermentation (température, pH et phase de croissance) sur la croissance et la résistance de L. lactis TOMSC161 à chaque étape du procédé de lyophilisation et au stockage a été étudiée. Alors que les performances de la souche ne sont pas dégradées après congélation, L. lactis s’est avéré sensible au séchage et au stockage à température ambiante. De plus, la température de fermentation et l’instant de récolte influencent la résistance au séchage de cette bactérie. Ainsi, les cellules de L. lactis TOMSC161 cultivées à 32 °C, pH 6,2 et récoltées tardivement (en phase stationnaire avancée) présentent une croissance optimale et la meilleure résistance à la lyophilisation et au stockage à 4 °C. Dans une seconde partie, une caractérisation approfondie de la membrane de L. lactis TOMSC161 aux niveaux biochimique et biophysique a été réalisée au cours de fermentations à différentes températures (22 et 30 °C) et a été mise en lien avec la résistance des ferments à la lyophilisation et au stockage. La cyclopropanation des acides gras insaturés de L. lactis TOMSC161 au cours de la fermentation est reliée à une rigidification de la membrane et permet d’améliorer la tolérance des cellules à la lyophilisation et au stockage. A l’inverse, la culture des cellules à une température inférieure à la température optimale de croissance induit une adaptation homéovisqueuse de la membrane, mise en évidence par la température de transition lipidique, mais n’a pas induite une amélioration de la résistance à ce procédé de préservation. Dans une troisième partie, la caractérisation de l’état physiologique des cellules de L. lactis TOMSC161 a été complétée au niveau du transcriptome, du protéome et de l’état d’oxydation cellulaire. Le procédé de lyophilisation provoque la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires qui dégradent la performance des ferments au cours du stockage. Par ailleurs, l’état d’oxydation des cellules diminue au cours de la fermentation et est expliqué, en phase stationnaire, par un ralentissement du métabolisme énergétique aérobie et une induction des réponses au stress oxydatif. Cette « pré-adaptation » initiale des cellules de L. lactis TOMSC161 au cours de la fermentation permet, là encore, une amélioration de leur tolérance à la lyophilisation et au stockage par une limitation de l’accumulation de ROS lors de ce procédé de préservation. Ce travail se conclut par une vérification des fonctionnalités du ferment lyophilisé, dans les conditions de production optimisées lors de cette thèse, en fabrication fromagère. Malgré l’étape de lyophilisation, les propriétés technologiques de L. lactis TOMSC161 sont conservées, validant ainsi le travail d’optimisation réalisé.Lactic acid bacteria, which have a significant industrial importance, are widely distributed in frozen or freeze-dried state for further use in industrial processes such as cheesemaking. However, stabilization processes (freezing or freeze-drying) causes different stresses which can lead to low survival rates and functionality losses of microorganisms. In this context, this thesis aimed at better understanding the impact of the physiological state of L. lactis TOMSC161 cells during fermentation on their freeze-drying and storage resistance, and at developing simple but efficient tools to evaluate the cells physiological state during fermentation for industrials.In the first part of this work, the influence of fermentation parameters (temperature, pH and harvesting time) on the growth and resistance of L. lactis TOMSC161 to each step of the freeze-drying process and storage has been investigated While the strain performance was not deteriorated after freezing, L. lactis was sensitive to the drying step and to ambient temperature storage. Moreover, the fermentation temperature and the harvesting time influenced the drying resistance of this bacterium. L. lactis TOMSC161 cells grown at 32 °C, pH 6.2 and harvested late (at late stationary phase) exhibited therefore both an optimal growth and the highest resistance to freeze-drying and storage at 4 °C. In the second part, a deep characterization of the L. lactis TOMSC161 membrane at a biochemical and biophysical level was analyzed during fermentation at different temperatures and was linked to the freeze-drying and storage resistance of starters. The cyclopropanation of unsaturated fatty acids of L. lactis TOMSC161 during fermentation was correlated with a membrane rigidification and allowed an improvement of the cell tolerance to freeze-drying and storage. Conversely, cultivating cells at lower fermentation temperature than the optimum growth temperature induced as expected a homeoviscous adaptation as evidenced by lowered lipid phase transition temperature but did not induce any improvement of resistance to this preservation process.In the third part, the physiological state characterization of L. lactis TOMSC161 cells was completed by investigating at the transcriptomic and proteomic levels as well as the cellular oxidation state. The results proved that the freeze-drying process caused intracellular reactive oxygen species (ROS) formation, responsible of degradation of the starter performance during storage at 25 °C. Furthermore, the cellular oxidation state decreased during fermentation and was explained, in the stationary phase, by a slowdown of the aerobic energy metabolism and the induction of oxidative stress responses. This initial “pre-adaptation” of L. lactis TOMSC161 during fermentation allowed improving their tolerance to freeze-drying and storage by a limitation of ROS accumulation through the whole preservation process.Finally, this work has been concluded by verifying the functionalities of starter freeze-dried in the optimized production conditions defined in this thesis during cheesemaking. Despite the freezedrying step, the technological properties of L. lactis TOMSC161 were preserved, thus validating the performed optimization