Development Of Proficiency Test Kit For Gmo Detection In Food And Feed Products

Laboratories performing GMO analysis are important components of the monitoring system and the national accreditation system. The most important way of ensuring and maintaining the quality of the experiments, calibration activities performed at these institutions at national and international level is to obtain successful results from proficiency tests and inter-laboratory comparison (PT / ILC) programs. In this way, they will be able to provide their adequacy of the services they offer. In this study, development of a proficiency test kit for the detection of genetically modified organisms (GMOs) by using MON87701 soybean and MIR604 maize events is aimed to establish a system that will be enable of using this test material in all the accredited laboratories performing GMO analysis in accordance with TS EN ISO / IEC 17043 standard. Thus, PT/ILC process was managed by preparation of proficiency test material, optimization of DNA extraction, single laboratory GMO analysis verification studies and interlaboratory comparison organization. Invitation letters were sent to 40 laboratories for the interlaboratory comparison and a total of 10 participant laboratories' qualitative and quantitative analysis outputs were reported. There was no PT/ ILC program server for GMO analysis in Turkey before the thesis. The Ministry of Agriculture and Forestry National Food Reference Laboratory has started to produce proficiency test which is related to screening analysis for GM feed. Prior to this period, all GMO analysis laboratories had dependencies on other countries. With this study; • The PT/ILC test kit and related analysis methods were developed, • The developed PT/ILC test kit in GMO analysis laboratories was implemented • In accordance with the international standard TS EN ISO/IEC 17043, a systematic was developed and implemented to provide accredited PT/ILC testing services. This study is the first inter laboratory work to be organized with the PT/ILC kit in Turkey under the international standard TS EN ISO / IEC 17043 and with this study we aimed that a consensus about methodology between laboratories, obtaining standard results. With this study, a new process, system and service were provided by the development and implementation of PT/ILC test.İÇİNDEKİLER ÖZET i ABSTRACT iii TEŞEKKÜR v İÇİNDEKİLER vi ÇİZELGELER xi ŞEKİLLER xiv SİMGELER VE KISALTMALAR xvii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Genetik Modifiye Organizma 3 2.2. Genetik Modifikasyonun Yapısı 4 2.2.1. Gen Kaseti, Promotör, Transgen ve Terminatör 5 2.2.1.1. Genetik Modifiye Bitkilerde Promotör Gen 6 2.3. DNA’yı Aktarmada Kullanılan Metotlar 7 2.3.1. Dolaylı Transformasyon 8 2.3.1.1. Agrobacterium tumefaciens aracılığı ile Transformasyon Yöntemleri 8 2.3.2. Doğrudan Transformasyon 8 2.3.2.1. Protoplast Oluşumu ve Elektroporasyon Yöntemleri 8 2.3.2.2. Bitki Hücresi veya Dokunun Mikropartikül Bombardımanı Yöntemi 9 2.3.3. Transformasyon Yöntemlerinin Karşılaştırılması 10 2.4. Genetik Modifiye Organizmaların Sınıflandırılması 10 2.4.1. Yeni DNA’nın Kökenine göre Yapılan Sınıflandırma 10 2.4.1.1. Tek Özellik Tipi (Single Trait Type) 11 2.4.1.2. Yığın Özellik Tipi (Stacked Trait Type) 11 2.4.1.3. Yakın Kalıt İçi Özellik Tipi (Near Intragenic) 11 2.4.1.4. Kalıt içi ve Cisgenic Özellik Tipi (Intragenics ve Cisgenics) 11 2.4.2. DNA Dizi Bilgisine Göre Sınıflandırma 12 2.4.2.1. Tamamen Karakterize Edilmiş GDO’lar (Bilgi Seviyesi 1) 12 2.4.2.2. Bilgi Seviyesi 1’de Kullanılan Aynı Genetik Yapı ile Transforme Edilen GDO’lar (Bilgi Seviyesi 2) 12 2.4.2.3. En Azından Bir Bileşeni Bilgi Seviyesi 1’de Bulunan Genetik Bileşenlerin Yeni Kombinasyonu ile Transforme olmuş GDO’lar (Bilgi Seviyesi 3) 13 2.4.2.4. Yalnızca Yeni Genetik Bileşenler ile Transforme Olmuş GDO’lar (Bilgi Seviyesi 4) 13 2.4.3. Onay Durumuna Göre GDO’ların Sınıflandırılması 13 2.4.3.1. Onaylanmış GDO’lar 13 2.4.3.2. Onaylanmamış GDO’lar 14 2.5. Dünyada Genetik Modifiye Bitkiler 14 2.6. Dünya Genelinde GD Özelllikler 15 2.7. GDO’ların İzlenmesi, Etiketleme ve Risk Analizi 18 2.8. GDO Tespitinde Analitik Metotlar 29 2.8.1. Proteine Dayalı GDO Saptanması 30 2.8.1.1. ELISA Yöntemi 30 2.8.1.2. Yatay Akış Çubukları (Lateral Flow Strips) 32 2.8.2. Nükleik Aside Dayalı GDO Tespiti 32 2.8.2.1. DNA ekstraksiyonu 32 2.8.2.1. DNA Mikrodizi (Microarray) 34 2.8.2.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Metodu 35 2.8.2.3. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR, Q-PCR) 37 2.8.3. RT-PCR’a Dayalı GDO Analizleri 38 2.8.3.1. RT-PCR’a Dayalı Tarama Yöntemi 39 2.8.3.2. RT-PCR’a Dayalı Gen Spesifik Metot 40 2.8.3.3. RT- PCR’a Dayalı Yapıya Spesifik Metot 40 2.8.3.4. RT-PCR’a Dayalı Çeşide Spesifik (Event-specific) Metot 40 2.8.4. GDO Analizi için RT-PCR (Q-PCR) Metotları 41 2.8.4.1. DNA’ya Bağlanan Boyalar ve Florofor İşaretli Oligonükleotid Teknikleri 41 2.8.4.2. Florofor İşaretli Oligonükleotid Teknikler 43 2.8.4.3. TaqMan ve SYBR Green I Tekniğinin Karşılaştırılması 44 2.9. Proteine Dayalı GDO Saptama Yöntemleri ile DNA’ya Dayalı GDO Saptama Yöntemlerinin Karşılaştırılması 46 2.10. GDO Saptanmasında Sertifikalı Referans Materyaller (CRM) 46 2.11. GDO Referans Sistemi 48 2.12. Nicel Analiz Tipleri 49 2.13. Güvenilir GDO Analizleri için İstatistiki Terimlerdeki Gereklilikler 49 2.13.1. Ölçüm Belirsizliği 49 2.13.2. Ölçüm Performansı 51 2.13.3. Güvenilir GDO Analizleri için Kullanılan Diğer İstatistiki Terimler 52 2.13.3.1. Z-skoru 52 2.13.3.2. Saptama Sınırı (LOD) ve Ölçüm Sınırı (LOQ) 52 2.13.3.3. Sağlamlık, Uygulanabilirlik, Pratiklik, Spesifiklik, Dinamik Kapasite, Amplifikasyon Verimi 53 2.14 Yeterlilik Testi Matrisleri 53 2.15. Yeterlilik Testi Tedarikçileri 54 2.16. Çalışmanın Amacı 55 3. MATERYAL VE METOT 56 3.1. Materyal 56 3.1.1. Sertifikalı Referans Materyaller 56 3.1.2. GD İçermeyen Unlar 56 3.1.3. Ekipmanlar 56 3.1.4. Kimyasallar 56 3.1.5. Sarf Malzemeler 57 3.1.6. Primer ve Problar 58 3.2. Metot 58 3.2.1. Yeterlilik Test Kiti 58 3.2.1.1. Yeterlilik Test Kiti Matrislerinin Türleri 58 3.2.1.2. Yeterlilik Test Kiti Matrislerinin Hazırlanması 59 3.2.1.3. Matrislerin Sertifikasyonu 63 3.2.2. DNA Ekstraksiyonu 66 3.2.2.1. DNA Ekstraksiyon Yöntemi 66 3.2.2.1.1. Örnekleme 66 3.2.2.1.2. Kapsam ve Uygulanabilirlik 66 3.2.2.1.3. Prensip 66 3.2.2.1.4. DNA Ekstraksiyonu Kit Kullanım Prosedürleri 67 3.2.2.1.5. DNA Ekstraksiyon Metodunun Deneysel Test Edilmesi 68 3.2.3. Tek Laboratuvar GDO Analizi 68 3.2.3.1. Genel Bilgi ve Metadolojinin Özeti 68 3.2.3.2. Metot Performans Özellikleri 70 3.2.3.2.1. Genel 70 3.2.3.2.2. Laboratuvar İçi Çalışma 70 3.2.3.2.3. Moleküler Spesifiklik 70 3.2.3.3. Prosedür 71 3.2.3.3.1. RT-PCR Nicel Analiz 71 3.2.3.3.1.1. Genel 71 3.2.3.3.1.2. Kalibrasyon 71 3.2.3.3.1.3. RT-PCR Hazırlanması 72 3.2.3.4. Verifikasyon Parametreleri 75 3.2.3.4.1. Yanlış Pozitif Oranı 75 3.2.3.4.2. Yanlış Negatif Oranı 75 3.2.3.4.3. İnhibisyon Testi 76 3.2.3.4.4. Minimum Tespit Sınırı (LOD) 76 3.2.3.4.5. Doğruluk 78 3.2.3.4.6. Tekrarlanabilirlik 79 3.2.3.4.7. Minimum Ölçüm Sınırı (LOQ) 79 3.2.3.4.8. Tekrar Üretilebilirlik 79 3.2.3.4.9. Laboratuvar Sapma (bias) Kontrolü 80 3.2.3.4.10. Ölçüm Belirsizliği 80 3.2.3.4.11. Stabilite Testi 80 3.2.4. Laboratuvarlar Arası Karşılaştırma Testi 80 3.2.4.1. Nitel Analizlerin Değerlendirmesi 81 3.2.4.2. Nicel Analiz Sonuçları İstatistiki Değerlendirmesi 81 3.2.4.3. Z-Skoru Değerlendirme 82 4. BULGULAR 83 4.1. DNA Ekstraksiyonu 83 4.1.1. DNA Konsantrasyonu ve Tekrarlanabilirlik 83 4.1.1.1. Yeterlilik Test Kiti Matrisleri 83 4.1.1.2. Sertifikalı Referans Malzeme 83 4.1.2. Safsızlık / PCR İnhibisyon Kontrolü 90 4.2. Tek Laboratuvar GDO Analizi 95 4.2.1. Validasyon Sonuçlarının Özeti 95 4.2.1.1. Referans Materyal 95 4.2.1.1.1. Yanlış Pozitif Oranı 96 4.2.1.1.2. Yanlış Negatif Oranı 97 4.2.1.1.3. İnhibisyon Testi 97 4.2.1.1.4. Minimum Tespit Sınırı (LOD) 97 4.2.1.1.5. Doğruluk 98 4.2.1.1.6. Tekrarlanabilirlik 100 4.2.1.1.7. Minimum Ölçüm Sınırı (LOQ) 102 4.2.1.1.8. Tekrar Üretilebilirlik 104 4.2.1.1.9. Laboratuvar Sapma (bias) Kontrolü 104 4.2.1.1.10. Ölçüm Belirsizliği 107 4.2.1.2. Yeterlilik Test Kiti 108 4.2.1.2.1. Yanlış Pozitif Oranı 108 4.2.1.2.2. Yanlış Negatif Oranı 109 4.2.1.2.3. İnhibisyon Testi 109 4.2.1.2.4. Minimum Tespit Sınırı (LOD) 109 4.2.1.2.5. Homojenlik Testi 110 4.2.1.2.5.1. Doğruluk 114 4.2.1.2.5.2. Tekrarlanabilirlik 116 4.2.1.2.7. Minimum Ölçüm Sınırı (LOQ) 118 4.2.1.2.8. Stabilite Testi 120 4.3. Laboratuvarlar Arası Karşılaştırma Testi 128 4.3.1. DNA Konsantrasyonu ve Değişim Katsayısı 128 4.3.2. Genetik Elementler Nitel Sonucu 130 4.3.3. Tip Belirleme Nitel Sonucu 136 4.3.4. Genel Değerlendirme 143 4.3.4. Nicel Analiz Sonuçları 146 5. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 150GDO analizi yapan laboratuvarlar hem bu konudaki izleme sisteminin hem de ulusal akreditasyon sistemin önemli bileşenlerindendir. Bu kuruluşlarda yapılan deney, kalibrasyon faaliyetlerinin ulusal ve uluslararası düzeyde kalitesinin sağlanmasının ve sürdürülmesinin en önemli yolu yeterlilik testleri ve laboratuvarlar arası karşılaştırma (YT/LAK) programlarından başarılı sonuçlar elde etmektir. Bu sayede sundukları hizmetlerin yeterliliği konusunda kanıt sağlamış olacaklardır. Bu çalışmada, genetik modifiye organizma (GDO) tespiti için MIR604 mısır çeşidi ve MON87701 soya çeşidi kullanılarak 8 farklı matristen oluşan yeterlilik test kitinin geliştirilmesi ve bu test materyali kullanılarak ülkemizde GDO analizi yapan laboratuvarlar tarafından TS EN ISO/IEC 17043 akredite yeterlilik testlerinde kullanılmasını sağlayacak bir sistematiğin oluşturulması ve uygulanması amaçlanmıştır. Bu süreç yeterlilik test materyali hazırlanması, DNA ekstraksiyonu optimizasyonu, tek laboratuvar GDO analizleri verifikasyon çalışmaları ve laboratuvarlar arası karşılaştırma organizasyonu aşamalarını içermektedir. Bu kapsamda laboratuvarlar arası karşılaştırma organizasyonu için 40 laboratuvara davet mektubu gönderilmiş ve bunlardan 10 katılımcı laboratuvarın nitel ve nicel analiz çıktıları raporlanmıştır. Türkiye’de GDO analizleri için YT/LAK program sunucusu teze başlamadan önce bulunmamaktaydı. İlk düzenlenme tarihi 01.04.2019 olan yemde GDO tarama ve GDO tarama kapsamındaki analizler için Tarım ve Orman Bakanlığı Ulusal Gıda Referans Laboratuvar Müdürlüğü de yeterlilik testi hazırlamaya başlamıştır. Bu süreçten öncesinde tüm GDO analiz laboratuvarlarının YT’nin sağlanmasında yurt dışı bağımlılığı bulunmaktaydı. Bu çalışma ile; • YT/LAK test kitini ve ilgili analiz metotlarını geliştirilmiş, • Geliştirilen YT/LAK test kitini GDO analiz laboratuvarlarında uygulanmış ve • TS EN ISO/IEC 17043 No'lu uluslararası standardı kapsamında akredite YT/LAK Testi hizmeti sunacak bir sistematik oluşturulmuş ve uygulanmıştır. Bu çalışma, Türkiye’de TS EN ISO/IEC 17043 No'lu uluslararası standardı kapsamında YT/LAK test kiti ile düzenlenen ilk laboratuvarlar arası ortak çalışma niteliğinde olup, laboratuvarlar arası metot birliği, standart sonuçların elde edilmesi ve GDO ile taklit ve tağşişin saptanması konusunda yoğun olarak karşılaşılan problemlerin aşılması hedeflenmiştir. Bu çalışma ile YT/LAK testi geliştirilmesi ve uygulanması ile yeni bir süreç, sistem ve hizmet tesisi etmek amaçlı süreç tanımlama yapılmıştır