Effects of tyrosine kinase inhibitors on IgE receptor-mediated signal transduction and activation of mast cells and basophils

In allergischen Erkrankungen spielen Mastzellen (MC) und Basophile (BA) eine wichtige Rolle. Beide Zellarten binden Immunoglobulin E (IgE) über einen spezifischen hoch-affinen Rezeptor (FcRI). Die IgE-abhängige Aktivierung initiiert eine Kaskade von Signalwegen, welche letztlich zur Degranulierung, Freisetzung von vorgeformten Mediatoren und zur Synthese von Membranlipiden und Zytokinen führt. Diese Moleküle spielen eine zentrale Rolle in allergischen Reaktionen. Protein Tyrosin Kinase-assoziierte Signalwege tragen entscheidend zur Aktivierung der MC und BA bei. Ein wichtiges initiales Ereignis in der Signaltransduktion vom FcRI auf der Oberfläche der MC und BA ist die Aktivierung der SRC Proteinkinasen. Ein weiteres wichtiges Signalmolekül ist die Bruton`s Tyrosinkinase (BTK). Die BTK Aktivierung wird durch SRC Moleküle (LYN und FYN) kontrolliert. Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass BTK ein mögliches therapeutisches Target in aktivierten MC und BA ist. Das Ziel des vorliegenden Projektes war es, die Effekte von BTK Inhibitoren auf die IgE-abhängigen Aktivierung und Histaminfreisetzung in BA zu untersuchen. Speziell wurde die Wirkung von vier BTK Inhibitoren (Ibrutinib, Dasatinib, AVL-292, CNX-774) auf die Expression von Signal- und Aktivierungsantigenen und die Histaminfreisetzung in BA getestet. Überdies wurden die Effekte dieser Medikamente auf das Wachstum der MC-Linie HMC-1 und BA-Linie KU812 untersucht. Als Marker der Zellaktivierung wurde die IgE-vermittelte Hochregulation von CD13, CD63, CD164 und CD203c durchflußzytometrisch bestimmt. Das Wachstum und die Viabilität der HMC-1 und KU812 Zellen wurde über 3H-Thymidineinbau und durchflußzytometrisch über Caspase 3 und Annexin-V/PI Färbungen quantifiziert. Die BTK Aktivierung in den BA wurde am effektivsten durch Dasatinib und Ibrutinib gehemmt. In den HMC-1 und KU812 Zellen blockierten Dasatinib, Ibrutinib, AVL-292 and CNX-774 die Expression von pS6 and pSTAT5. Alle vier BTK Inhibitoren unterdrückten dosisabhängig die anti-IgE- und Allergen-induzierten Histaminfreisetzung in BA, und zwar mit folgendem Wirkungsgrad: Ibrutinib>AVL-292>Dasatinib>CNX-774. Dasatinib und Ibrutinib unterdrückten auch die anti-IgE und Allergen-induzierte Hochregulation von CD13, CD63, CD164 und CD203c in den BA. Das Wachstum der HMC-1 und KU812 Zellen wurde durch Dasatinib und CNX-774 inhibiert, während Ibrutinib und AVL-292 keinen wesentlichen Effekt erzielten. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass BTK-Inhibitoren die IgE-abhängige Aktivierung der BA hemmen kann. Die klinische Bedeutung dieser Beobachtung muss in klinischen Studien untersucht werden.The principal effector cells in the IgE-related allergy are mast cells (MC) and basophilic granulocytes (BA). Both cell types bind immunoglobulin E (IgE) through its high affinity receptor (FcRI). Signalling cascade, associated with FcRI, is initiated by a cross-linking of the IgE-preloaded receptor with an allergen. Thus, activated FcRI-related signalling pathway lead to the degranulation of MC and BA. During the process of degranulation, pre-formed madiators are released from these activated effector cells. Activation of MC and BA also triggers de novo synthesis of various cytokines and lipid mediators that are important contributors to allergic reactions. Protein tyrosine kinase-associated signaling contributes essentially to the activation of MC and BA. The activation of SRC kinase family members is an important initial event in the signal transduction cascade activated by cross-linking FcRI on MC and BA. The Brutons tyrosine kinase (BTK) may be considered as a constitutive and essential part of signalling pathway that mediates MC and BA activation induced by allergens. Moreover, the activation of BTK is controlled by SRC family members such as LYN or FYN. Thus, BTK may be a potential therapeutic target in FcRI cross-linked BA. In this study, I tested BTK-specific inhibitors: ibrutinib, dasatinib, AVL-292, CNX-774. The inhibitory effects of BTK specific drugs were tested on signal transduction in BA. The effects of BTK inhibitors on activation of human BA were evaluated in functional assays: IgE-dependent activation and histamine secretion in human basophilic granulocytes. IgE-related activation of BA was determined by flow cytometry measuring the upregulation of activation markers (CD13, CD63, CD164 and CD203c) after challenging with anti-IgE or allergen. I examined the effects of BTK-specific inhibitors on growth of the MC line HMC-1 and the BA line KU812. In these experiments, growth and survival of HMC-1 and KU812 cells were determined by measuring incorporation of 3H-thymidine into the cells. In addition, to examine the effects of BTK inhibitors on apoptosis active Caspase 3 and Annexin-V/propidium iodide (PI) staining were performed. The most prominent effects on expression of phosphorylated (p) BTK in IgE-activated human BA were achieved with dasatinib and ibrutinib. In HMC-1 and KU812 cells, the activation of the BTK-downstream signaling molecules AKT, S6, STAT5 and SYK was partially affected by the BTK inhibitors. Ibrutinib and dasatinib were the most potent inhibitors of activation and histamine secretion from challenged BA. In conclusion, BTK-specific inhibitors are potent suppressors of the IgE-mediated activation of human BA. The clinical potency of BTK inhibitors in allergic disorders remains to be assessed in clinical trials.Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersArbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüftMedizinische Universität Wien, Diss., 2018(VLID)359773