Razvoj metode za spremljanje transporta proteinov s klatrinskimi vezikli pri parazitu Plasmodium berghei

Malaria is caused by the Apicomplexan parasite Plasmodium, which has a very complex life cycle involving various changes and modifications to the parasite itself as well as to the cells it resides in. To better understand how parasite invades red blood cells, obtains nutrients and remains hidden from its host, it is important to deepen our knowledge in parasite cell biology. Changes in the host cell are mediated by a wide array of exported proteins, but the specific role and transportation pathways of a large proportion is not yet well understood. Clathrin is a vesicular coating protein expected to act in Plasmodium intracellular trafficking but knowledge about proteins that are being transported in clathrin-coated vesicles is very limited. In this work we have addressed nine Plasmodium berghei proteins which are exported or localised in various cell locations and might be transported in a clathrin-dependent manner. To obtain more information how these proteins are trafficked, we prepared plasmids for C-terminal tagging of endogenous Plasmodium proteins with fluorescent protein TagBFP and HA epitope tag. The plasmids have been transfected in a genetically modified parasite line which enables the use of the molecular technique knocksideways. Upon addition of rapamycin, the clathrin in knocksideways parasites is relocalised to the parasite membrane, thus inactivating clathrin-dependent trafficking pathways. This allows investigation of the effect of inactivating clathrin-mediated protein trafficking on the protein of interest. We have endogenously tagged nine proteins in the rodent malaria parasite P. berghei and inspected how successful the process of integration and protein expression has been. Integration screening was followed by analyses with flow cytometry and imaging flow cytometry to visualise protein expression and localisation. One of the nine studied is Zn finger protein of an unknown function (PBANKA_141590), which has been examined further in our work. We determined how the expression of the protein changes during intra-erythrocytic development and obtained information about protein localisation. Live imagestream and microscopy studies indicate that it is a nuclear protein. Knocksideways experiments indicate the protein does not depend on clathrin for its nuclear localisation. The studies on this protein illustrate the range of information that can be obtained about a previously unstudied protein using these methods. We have generated plasmids and parasite lines that provide new tools to study and contribute towards understanding of protein functions and Plasmodium protein transportation pathways.Malarija je ena izmed najbolj razširjenih bolezni nerazvitega sveta, značilna predvsem za tropska in subtropska področja Afrike, Jugovzhodne Azije in Južne Amerike. Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije letno še vedno zboli preko 200 milijonov ljudi, od katerih jih skoraj pol milijona umre. Najbolj ranljiva skupina obolelih so otroci, mlajši od pet let, ki še niso uspeli razviti delne imunosti, zato je pri njih potek bolezni običajno resnejši in pogosto vodi v zaplete s smrtnim izidom. Bolezen prenašajo samice komarjev iz rodu Anopheles, njen povzročitelj pa je enocelični parazit plazmodij. Plazmodij ima zelo zapleten življenjski cikel, ki delno poteka v vretenčarjih, spolni del življenjskega cikla pa poteka v samicah komarjev. Okuži lahko sesalce, ptiče in plazilce. Poznamo pet vrst plazmodijev, ki okužijo človeka. Najbolj razširjen je Plasmodium falciparum, ki je odgovoren za skoraj vse okužbe v Afriki in večino v Aziji, medtem ko je za večino okužb v Ameriki odgovoren P. vivax. Znani so tudi primeri okužb s P. malariae, P. ovale in P. knowlesi. Med najbolj prepoznavne znake okužbe z malarijo spadajo vročina, drgetanje, potenje in krči. Sproži jih nespolno razmnoževanje plazmodija v rdečih krvničkah, ki po zaključku vsakega razmnoževalnega cikla povzročijo pokanje eritrocitov. Okužba se prične s pikom komarja, ki skupaj s tekočino iz žlez slinavk v podkožje ali krvni obtok vnese plazmodije v obliki sporozoitov. Ti po krvožilju potujejo do jeter in se naselijo v jetrnih celicah. Tekom številnih delitev se iz posameznega sporozoita razvije na stotine merozoitov, ki sprožijo pokanje hepatocitov. Merozoiti v krvnem obtoku prepoznajo rdeče krvničke, vanje vstopijo in se obdajo s posebno parazitovo vakuolo (ang. parasitophorous vacuole). Vakuola jih ščiti pred imunskim odzivom in okoljem gostiteljske celice, a predstavlja tudi oviro, saj otežuje dostop do hranil iz okolice. V eritrocitih se plazmodij razvije preko razvojne stopnje trofozoit do večjedrne oblike shizont, ki predstavlja zrelo nespolno obliko plazmodija. Shizont sproži pokanje rdeče krvničke in v kri izpusti t.i. merozoite, ki znova okužijo eritrocite. Cikli nespolnega razmnoževanja znotraj rdečih krvničk eksponentno povečujejo število okuženih krvnih celic in botrujejo k razvoju bolezenskih znakov. Ker je omenjeno razmnoževanje zgolj nespolno, plazmodiju ne omogoča preživetja izven gostiteljskega organizma. Del plazmodijev (>10 %) zato tekom znotrajceličnega razvoja v eritrocitu namesto nespolnega razmnoževanja preide na spolno in tvori ženske in moške spolne celice – gametocite. Slednji krožijo po krvnem obtoku, čakajoč na pik komarja. V komarjevem črevesju sprememba temperature in pH-ja omogoči razvoj mikro- in makrogamet, ki se združijo v zigoto, ta pa se razvije v motilno obliko ookineto, ki prečka črevesno steno. Iz nje se razvije oocista, iz katere se ob njenem poku sprostijo sporozoiti, ki potujejo v žleze slinavke. Ob vnovičnem piku komarja se sporozoiti prenesejo v človeka in sklenejo življenjski cikel plazmodija. Preživetje v komarju ter gostiteljskem organizmu je odvisno od prilagoditvenih sposobnosti plazmodija na življenje v različnih celičnih okoljih, izrabe hranil gostitelja ter izogibanja zaznavi imunskega sistema. V ta namen je plazmodij razvil vrsto prilagoditev in mehanizmov, ki mu omogočajo izvoz proteinov za povečanje prepustnosti ter preoblikovanje rdečih krvničk. P. falciparum npr. spremeni membrano eritrocitov ter celicam omogoči adherenco, kar sproži sekvestracijo v krvožilju in zaščiti plazmodij pred imunsko zaznavo v vranici. Transport proteinov skozi membrano parazitske vakuole poteka s posebnim, za plazmodij specifičnim transportnim sistemom, imenovanim PTEX (ang. Plasmodium Translocon of Exported Proteins). Gre za proteinski kompleks, ki v membrani tvori poro, skozi katero se v eritrocit prenesejo številni proteini, namenjeni za izvoz. Razdelimo jih lahko v dve skupiniprvo, dokaj enovito, opredeljuje zaporedje petih aminokislin, t.i. izvozni motiv PEXEL. Druga skupina je precej raznolika, saj proteini nimajo prepoznavnega motivav veliki meri jim je skupna le hidrofobna regija znotraj strukture proteina. Imenujejo se PNEP oz. »za PEXEL negativni izvoženi proteini« (ang. PEXEL-negative Exported Proteins). V zadnjem času je bilo mnogo raziskav osredotočenih na zgradbo in delovanje transportnega sistema PTEXznotrajcelični transport, ki proteine prenaša med celičnimi organeli in do kompleksa PTEX, pa je še vedno precej neraziskan. Znano je, da ima plazmodij, tako kot drugi evkarionti, vse glavne skupine proteinov, ki sestavljajo plašč transportnih veziklov. Gre za vezikle COPI, COPII in klatrinske vezikle, ki jih prepoznamo po t.i. plašču oz. ogrodju iz omenjenih proteinov. COPI in COPII običajno sodelujejo pri transportu med endoplazemskim retikulumom in Golgijevim aparatom (GA), medtem ko klatrinski vezikli prenašajo proteine med GA in celično membrano. Za sestavo proteinskega plašča okoli fosfolipidne membrane vezikla ne zadostujejo zgolj plaščni proteini, pri oblikovanju ter predvsem izbiri proteinskega »tovora« jim pomagajo t.i. adapterski proteini (AP). V našem delu smo se osredotočili na transport s klatrinskimi vezikli, za katere je znano, da interagirajo z AP1-3. Pri plazmodiju oz. predstavnikih debla Apicomplexa, v katerega uvrščamo tudi plazmodija, je doslej najbolj preučen AP1. Dokazali so, da je potreben za nastanek in oblikovanje roptrij in mikronem, specifičnih organelov, ki sodelujejo pri vstopu v eritrocite. Doslej je poznavanje omejeno na zgolj nekaj proteinov, velika večina ter mehanizmi njihovega prenosa pa ostajajo neraziskani. V magistrskem delu smo zato preučili devet endogenih proteinov plazmodija, ki se nahajajo v različnih delih celice parazita oz. sodelujejo pri izvozu proteinov iz celice. Pri delu smo uporabili živalski model malarije, vrsto P. berghei, ki okuži glodalce. P. berghei je primeren model za raziskave, saj ima krajši življenjski cikel (razvoj v eritrocitu traja 1 dan, pri P. falciparum pa 2 dni), v primerjavi z ostalimi plazmodiji je dokaj enostaven za gensko spreminjanje, delo z njim je varno in preprosto, plazmodije pa je mogoče preučevati tudi in vivo v miših. Magistrsko delo je sestavljeno iz dveh večjih sklopovv prvem smo se osredotočili na pripravo vektorjev za C-končno označevanje endogenih proteinov plazmodija, v drugem pa smo plazmodije transficirali s pripravljenimi vektorji in ustvarili transgenske parazitske linije. Beseda linija se nanaša na plazmodije, pridobljene iz krvi miši, ki smo jo okužili s transficiranimi plazmodiji. Ker transfekcija ni zelo učinkovita, je bil del parazitov v krvi še vedno divji tip. V nadaljevanju smo zato vse pripravljene linije tudi preučili, da bi ugotovili, kako uspešna je bila priprava in ali se je C-končni označevalec vgradil na želeno mesto v genomu. Vektor za C-končno označevanje je vključeval dve proteinski oznaki, ki sta bili spojeni v fuzijo. Šlo je za TagBFP (modri fluorescenčni protein), ki je bil na C-koncu spojen s trojnim hemaglutininskim označevalnim epitopom (oznako HA). Navzgor od zapisa za dvojno oznako je bilo klonirno mesto, preko katerega smo v istem odprtem bralnem okvirju v vektor vstavili 3’-konec nukleotidnega zaporedja preučevanega gena brez stop kodona. Na tak način smo pripravili devet končnih vektorjev, ki so imeli v istem odprtem bralnem okvirju spojenih ~500-2000 baznih parov nukleotidnega zaporedja s 3’-konca tarčnega gena ter zapisa za protein TagBFP in oznako HA. 3’-konec nukleotidnega zaporedja gena je služil enojni homologni rekombinaciji, do katere v plazmodiju pride, kadar imajo vektorji, uporabljeni za transfekcijo le eno regijo, identično tarčnemu genu. Tako lahko ustvarimo fuzijo preučevanega endogenega proteina plazmodija in pripravljene oznake. Oznaka TagBFP je bila namenjena zaznavi in opazovanju proteina s fluorescenčno mikroskopijo in pretočno citometrijo, oznaka HA pa je služila analizi proteinov s prenosom western. Da bi lahko preučili povezavo med klatrinom in izbranimi proteini, smo za transfekcijo uporabili plazmodije, ki so že bili gensko spremenjeni. Uporabili smo plazmodije, ki omogočajo izvedbo molekularne tehnike »knocksideways«. »Knocksideways« deluje na osnovi heterodimerizacije domen FKBP in FRB ob dodatku rapamicina. Obe domeni sta izraženi v plazmodiju najpogosteje v obliki proteinske fuzije z dvema drugima proteinomaprvi služi kot sidro, drugi pa je protein, ki mu želimo spremeniti lokalizacijo. Transgenska linija plazmodija je bila pripravljena tako, da je sidro predstavljal plazmodijev endogeni transmembranski protein (PBANKA_110790), ki je bil na N-koncu spojen s FRB-domeno in fluorescenčnim proteinom mCherry. C-konec težke verige klatrina je bil spojen z domeno FKBP in GFP-jem. Ob dodatku rapamicina se je klatrin zato preusmeril na membrano plazmodija, kar je onemogočilo delovanje klatrinskih veziklov. Opisano linijo plazmodijev smo imenovali klatrinska KS (»knocksideways«) linija. Ko smo plazmodije transficirali s pripravljenimi vektorji, smo v plazmodij torej vnesli še tretji fluorescenčni protein, TagBFP. Klatrinsko KS-linijo plazmodijev smo transficirali s pripravljenim vektorjem, pogosto pa smo na enak način C- končno označili tudi protein v divjem tipu plazmodijev. Za vsakega izmed preučevanih proteinov smo torej pripravili eno ali dve novi transgenski liniji plazmodijev. Po transfekciji smo plazmodije intravensko injicirali v miš in z opazovanjem krvnih razmazov pod svetlobnim mikroskopom dnevno spremljali indeks parazitemije (določili smo odstotek okuženih eritrocitov v krvi). Ko je ta dosegla 0,5-5 %, smo miši odvzeli kri ter jo uporabili za nadaljnje analize. Kri smo najprej lizirali, da smo odstranili eritrocite. Iz pridobljenih plazmodijev smo nato izolirali DNA ali pripravili celični lizat za analizo s prenosom western. Genomsko DNA smo uporabili za genotipizacijo, kjer smo z verižno reakcijo s polimerazo s posebej načrtovanimi začetnimi oligonukleotidi pomnožili transgenski ali endogeni lokus ter preverili, ali se je C-končni označevalec vgradil v genom plazmodija. Druga večja analiza je bila analiza s pretočno citometrijo, kjer smo preverjali izražanje fuzijskega proteina. Namesto lizirane krvi smo uporabili svežo kri ali prekonočno in vitro celično kulturo plazmodijev. V primeru, da je bila integracija v genom uspešna in se je proteinska fuzija tudi izražala, smo to zaznali z modro fluorescenco, ki je posledica izražanja TagBFP. Večino pripravljenih linij smo analizirali z vsaj še eno analizo, to je bil ali prenos western ali t.i. slikovna pretočna citometrija (ang. imaging flow cytometry). Slikovna pretočna citometrija je metoda, ki združuje mikroskopijo in pretočno citometrijo. Sistem deluje na podobni osnovi kot pretočna citometrija, a je mogoče vsako izmed zaznanih celic pogledati tudi kot sliko, ki jo je posnela kamera, nameščena znotraj sistema. Resolucija slik je slabša kot pri mikroskopiji, vendar zadošča za pridobitev kvalitativne informacije, ali se fuzijski protein izraža ali ne. Ugotovili smo, da je bila fuzija s C-koncem tarčnih proteinov plazmodija pri večini pripravljenih transgenskih linij plazmodijev uspešna, saj se je fuzijski protein izražal. Pripravljene linije plazmodijev so pomemben doprinos k raziskovalnemu delu na področju preučevanja klatrinskega transporta v P. berghei. Enega izmed proteinov plazmodija, ki se je pokazal kot najbolj obetaven za nadaljnje raziskave klatrinskega transporta, smo podrobneje preučili. Gre za produkt gena PBANKA_141590, ki zapisuje protein cinkovega prsta z neznano funkcijo. Preučili smo, kako se izražanje tega proteina spreminja tekom plazmodijevega razvoja v eritrocitih in ali se protein izraža tudi v spolnih celicah – gametocitih. Ugotovili smo, da se njegovo izražanje poviša v poznem nespolnem razvoju (približno 15 ur po okužbi eritrocita) ter da se izraža tudi v gametocitih. Nadalje smo pripravljene plazmodije uporabili tudi v eksperimentu “knocksideways”, kjer smo s fluorescenčno mikroskopijo preučevali lokalizacijo proteina v odsotnosti oz. prisotnosti rapamicina. Na osnovi rezultatov mikroskopije, ki je pokazala, da se protein v obeh pogojih nahaja v jedru plazmodijev, smo zaključili, da transport tega proteina najverjetneje ne poteka neposredno s klatrinskimi vezikli