Caracterização e otimização dos métodos de cultivo dos fungos Armillaria sp., Botrytis cinerea e Diplonia pinea, estudo químico e avaliação das atividades biológicas de extratos de Diplodia pinea

Orientadora : Profª. Drª. Marilis Dallarmi MiguelCoorientadores : Prof. Dr. Celso Garcia Auer, Profª Drª Cristiane da Silva Paula de OliveiraDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 20/02/2017Inclui referências : f. 139-148Área de concentração: Insumos, medicamentos e correlatosResumo: Os fungos Armillaria sp., Botrytis cinerea e Diplodia pinea, são classificados como fungos patopatogênicos sendo capazes de causar doenças severas e morte de algumas plantas como o Pinus sp. O Pinus é uma conífera que foi introduzida no Brasil, principalmente no Sul e Sudeste, como madeira de reflorestamento, na produção de madeira, celulose e seiva. Esta planta tem grande importância econômica no Brasil, movimentando milhões de dólares todos os anos. A ausência de trabalhos que estudem fungos fitopatogênicos correlacionando-os com atividades biológicas, foi um dos fatores determinantes para a realização desta pesquisa e impulsiona a continuidade da mesma. Foram determinadas as melhores condições de cultivo, visando a maior produção de massa fúngica por gravimetria para cada patógeno, sendo avaliados os parâmetros de melhor temperatura, melhor tempo de cultivo e melhor meio de cultura. Obteve-se como resultados para as melhores condições de cultivo dos fungos o meio batata dextrose, em temperaturas de 12 ºC e 20 ºC e um tempo de cultivo de 35 dias. Especificamente para o fungo Diplodia pinea, foi realizado um estudo aprofundado sendo traçado o seu perfil químico e biológico por diversas metodologias. Foram produzidos os extratos do meio de cultivo e da massa fúngica, sendo que a partir do micélio obtiveram-se os extratos hexano, clorofórmio, acetato de etila, metanol e 50% etanol/50% água. Esses extratos foram analisados quimicamente pelas técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-UV), cromatografia em camada delgada (CCD) e testes histoquímicos. Foram realizadas as análises físico químicas de pH, umidade, cinzas, proteínas, lipídeos e fibras brutas. Realizou-se a pesquisa de quitina bem como a de exopolissacarídeos, sendo por fim realizados os testes biológicos de avaliação do potencial tóxico pelas metodologias de hemácias em suspenção, placas de ágar sangue e frente à Artemia salina; potencial antimicrobiano pela metodologia da concentração inibitória mínima, antioxidante pelas metodologias de redução do radical do DPPH e fosfomolibdênio e análise de compostos fenólicos pelo método de Folin Ciocalteau. Como resultados pode-se afirmar que os extratos do fungo apresentam na CLAE-UV picos característicos de substâncias químicas polares e apolares; foi constatada positividade predominante para esteroides, triterpenos e polifenois na análise de CCD, os testes histoquímicos indicaram a possibilidade de positividade para alcaloides, polissacarídeos neutros, lignina e terpenoides. Nas análises fisíco químicas obteve-se os valores de pH de 6,12, teores de umidade e cinzas de 8,23% e 2,25%, respectivamente. Para proteínas, lipídeos e fibras brutas foram encontrados os valores de 13,9%, 8,9% e 27,8%, respectivamente. Para a quitina e exopolissacarídeos o fungo apresentou positividade. Nos testes biológicos os extratos hexano, clorofórmio e do meio de cultivo apresentaram toxicidade significativa, bem como atividade antioxidante para os extratos acetato de etila, etanol/água e do meio de cultivo. O potencial antimicrobiano foi considerado baixo para todas as amostras testadas. Esse perfil traçado para os patógenos e os testes aprofundados com o fungo Diplodia pinea são considerados um grande avanço nas pesquisas com esses microorganismos e um direcionamento importante para novos estudos científicos. Palavras-chave: Pinus sp., Armillaria sp., Botrytis cinerea, Diplodia pinea, perfil químico, análises biológicas, cultivo in vitro.Abstract: The fungi Armillaria sp., Botrytis cinerea and Diplodia pinea, are classified as pathogenic fungi being able to cause severe diseases and death of some plants such as Pinus sp. Pinus is a conifer that was introduced in Brazil, mainly in the South and Southeast, as reforestation wood, in the production of wood, cellulose and sap. This plant has great economic importance in Brazil, moving millions of dollars every year. The absence of studies that study phytopathogenic fungi correlating them with biological activities was one of the determining factors for the accomplishment of this research and it drives the continuity of the same one. The best cultivation conditions were determined, aiming at the greatest production of fungal mass by gravimetry for each pathogen, being evaluated the parameters of better temperature, better culture time and better culture medium. The potato dextrose medium at temperatures of 12 ° C and 20 ° C and a culture time of 35 days were obtained as the best conditions for growing the fungi. Specifically for the fungus Diplodia pinea, an in-depth study was carried out, tracing its chemical and biological profile by several methodologies. The extracts of the culture medium and the fungal mass were produced, and extracts of hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol and 50% ethanol / 50% water were obtained from the mycelium. These extracts were chemically analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC-UV), thin layer chromatography (CCD) and histochemical tests. Physical and chemical analyzes of pH, moisture, ashes, proteins, lipids and crude fibers were carried out. Chitin as well as exopolysaccharide research were carried out. Finally, the biological tests for the evaluation of the toxic potential were carried out by the methods of suspension red cells, blood agar plates and Artemia salina; Antimicrobial potential by the methodology of minimum inhibitory concentration, antioxidant by the DPPH and phosphomolybdenum radical reduction methodologies and the analysis of phenolic compounds by the Folin Ciocalteau method. As a result it can be stated that the extracts of the fungus present in the HPLC-UV characteristic peaks of polar and apolar chemical substances; Predominant positivity for steroids, triterpenes and polyphenols in CCD analysis, histochemical tests indicated the possibility of positivity for alkaloids, neutral polysaccharides, lignin and terpenoids. In the chemical-physical analysis, the pH values were 6.12, moisture contents and ashes of 8.23% and 2.25%, respectively. For proteins, lipids and crude fibers were found the values of 13.9%, 8.9% and 27.8%, respectively. For chitin and exopolysaccharides the fungus presented positivity. In the biological tests extracts hexane, chloroform and culture medium showed significant toxicity as well as antioxidant activity for extracts ethyl acetate, ethanol / water and culture medium. The antimicrobial potential was considered low for all the samples tested. This profile for the pathogens and the in-depth tests with the fungus Diplodia pinea are considered a major advance in research with these microorganisms and an important direction for new scientific studies. Key words: Pinus sp., Armillaria sp., Botrytis cinerea, Diplodia pinea, chemical profile, biological analyzes, in vitro culture