Estudo do efeito da hidroxiureia e da Vitamina C em eritrócitos normais, submetidos a estresse oxidativo

Orientador : Prof. Dr. Aguinaldo José do NascimentoOrientadora : Profª. Drª. Maria Suely Soares LeonartAutor não autorizou a divulgação de impresso e digitalDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 19/03/2014Inclui referênciasÁrea de concentração: Análises clínicasResumo: Os eritrócitos são células altamente especializadas, continuamente expostas ao estresse oxidativo. No eritrócito humano maduro, o estresse oxidativo leva à formação de meta-hemoglobina (meta-Hb) que, por sua vez, aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), ocasionando mudanças no citoesqueleto da membrana eritrocitária e hemólise. A compreensão dos mecanismos que levam ao estresse oxidativo tem esclarecido muitos dos processos que levam à lesão e morte celular. O presente estudo teve como objetivo avaliar a ação da vitamina C e da hidroxiureia (HU) no metabolismo oxidativo de eritrócitos normais expostos a agentes oxidantes, in vitro. Foram obtidas amostras de sangue de 24 indivíduos considerados normais, selecionados entre estudantes e servidores da Universidade Federal do Paraná (UFPR), conforme aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Setor de Ciências da Saúde da UFPR. Os eritrócitos foram incubados com vitamina C ou HU e, posteriormente, com os agentes oxidantes terc-butilhidroperóxido (t-BHP) ou 2,2'azobis (2-metil-propionamidina) dihidrocloro (AAPH). Foram realizadas determinações de concentrações de glutationa reduzida (GSH), meta-Hb, ERO, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), porcentagens de hemólise e atividades da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase (G6-PD) no estado basal e após ação dos agentes oxidantes, com ou sem proteção pela vitamina C ou HU. Houve diminuição nos níveis basais de GSH de 96% em amostras incubadas com t-BHP, 1 mmol/l (de 6,8 ± 1,4 para 0,3 ± 0,1 ?moles/g Hb), sem influência de incubação prévia com vitamina C ou HU. Observou-se aumento de cerca de 3 vezes na formação de meta-Hb em amostras incubadas com t-BHP, 2 mmoles/l (de 2,8 ± 0,3 para 9,1 ± 2,5%), sem influência de incubação prévia com vitamina C ou HU. A formação de ERO basal (1535 ± 522 UF/g Hb) aumentou aproximadamente 30 vezes em amostras incubadas com t-BHP, 175 ?moles/l (42716 ± 13608 UF/g Hb), observando-se proteção com aumento de apenas 9 e 10 vezes, quando se incubou previamente com vitamina C, 50 ?moles/l (13122 ± 5617 UF/g Hb) e HU, 2 mmoles/l (16025 ± 6008 UF/g Hb),respectivamente.Houve aumento na formação de TBARS de aproximadamente 3 vezes em amostras incubadas com t-BHP, 2 mmoles/l (de 56,7 ± 15,6 para 167,0 ± 52,7 nmoles/g Hb) e, respectivamente, de 1,2 e 1,5 vezes em amostras previamente tratadas com vitamina C, 10 mmoles/l (69,1 ± 18,3 nmoles/g Hb) e HU, 1 mmol/l (85,7 ± 27,6 nmoles/g Hb). A porcentagem de hemólise aumentou de 7 para 86,6% em eritrócitos normais incubados com AAPH, 200 mmoles/l, e para 8,8 e 33,9%, quando previamente incubadas com vitamina C, 10 mmoles/ e HU, 1 mmol/l, respectivamente. Houve diminuição da atividade de G6-PD de 63% nas amostras tratadas com t-BHP, 5 mmoles/l (de 7,0 ± 0,9 para 2,6 ± 0,8 UI/g Hb) e cerca de 58 e 42% nas amostras tratadas com vitamina C, 10 mmoles/l (2,9 ± 0,6 UI/g Hb) e HU, 1 mmol/l (4,1 ± 0,6 UI/g Hb), respectivamente. Foi observado que vitamina C e HU, nas concentrações testadas, possuem capacidade de prevenir parcialmente danos oxidativos induzidos in vitro, observados principalmente pela formação de TBARS e ERO e pelas porcentagens de hemólise. A partir dos resultados obtidos, sugere-se que o uso terapêutico de vitamina C ou de HU pode se correlacionar com menor estresse oxidativo e melhora na defesa antioxidante.Abstract: Red blood cells are highly specialized cells continuously exposed to oxidative stress. In mature human erythrocyte the oxidative stress leads to formation of methemoglobin (metHb) which, in turn, increases the production of reactive oxygen species (ROS), causing changes in erythrocyte membrane cytoskeleton and hemolysis. Knowledge of the mechanisms that lead to oxidative stress has clarified many of the processes that cause injury and cell death. The aim of this study was to evaluate the action of vitamin C and hydroxyurea (HU) in the oxidative metabolism of normal erythrocytes exposed to oxidizing agents in vitro. Blood samples were obtained from 24 individuals considered normal, selected among students and servers of Universidade Federal do Paraná (UFPR). Red blood cells were incubated with vitamin C or HU and subsequently with the oxidizing agents tert-butylhydroperoxide (tBHP) or 2,2?azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH). Concentrations of reduced glutathione (GSH), metHb, ROS, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), percentages of hemolysis, and activities of the enzyme glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6-PD) in the basal state and after oxidizing agent actions, with or without the protection action of vitamin C or HU were determined. There was decrease in basal levels of GSH up to 96% in samples incubated with tBHP, 1 mmol/l (6.8 ± 1.4 to 0.3 ± 0.1 ?mol/g Hb), without influence of prior incubation with vitamin C or HU. It was observed an increase of about 3 times in the formation of metHb in samples incubated with tBHP, 2 mmol/l (2.8 ± 0.3 to 9.1 ± 2.5%), without influence of prior incubation with vitamin C or HU. Formation of basal ROS (1535 ± 522 FU/g Hb) was approximately 30 times higher in samples incubated with tBHP, 175 ?mol/l (42716 ± 13608 FU/g Hb), and; 9 and 10 times in samples incubated with vitamin C, 50 ?moles/l (13122 ± 5617 FU/g Hb) and HU, 2 mmol/l (16025 ± 6008 FU/g Hb), respectively. There was an increase in TBARS formation of approximately 3 times in samples incubated with tBHP, 2 mmol/l (56.7 ± 15.6 to 167.0 ± 52.7 nmol/g Hb), respectively, and 1.2 and 1.5 times in samples treated with vitamin C, 10 mmol/l (69.1 ± 18.3 nmol/g Hb) and HU, 1 mmol/l (85.7 ± 27.6 nmol/g Hb). The percentage of hemolysis increased from 7 to 86.6% in normal erythrocytes incubated with AAPH, 200 mmol/l, and to 8.8 and 33.9%, when treated with vitamin C, 10 mmol/ and HU, 1 mmol/l, respectively. There was decreased activity of G6-PD of 63% in samples treated with tBHP, 5 mmol/l (7.0 ± 0.9 to 2.6 ± 0.8 IU/g Hb) and about 58 and 42% in samples treated with vitamin C, 10 mmol/l (2.9 ± 0.6 IU/g Hb) and HU, 1 mmol/l (4.1 ± 0.6 IU/g Hb), respectively. It was observed that vitamin C and HU, in the concentrations tested, have ability to partially prevent oxidative damage induced in vitro, observed primarily by the TBARS and ROS formation, and the percentages of hemolysis. From the results obtained, it is suggested that the therapeutic use of vitamin C or HU could correlate with lower oxidative stress and it improves antioxidant defense