Desenvolvimento de biomaterial de quitosana e heteroramnana sulfatada estimulando células-tronco na produção de matriz extracelular

Orientador : Prof. Dr. Miguel Daniel NosedaCoorientadores : Profª. Drª. Maria Eugênia D. Noseda e Profª. Drª. Katherine A. T. de CarvalhoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 30/06/2017Inclui referências : f. 169-196Resumo: A engenharia de tecidos é uma área da medicina regenerativa que vem ganhando destaque no desenvolvimento alternativo de tecidos e órgãos para transplantes, utilizando principalmente células-tronco e biomateriais. O objetivo da presente pesquisa foi o desenvolvimento de biomaterial a base de polissacarídeo, avaliando sua aplicação no cultivo de células-tronco mesenquimais. Os polissacarídeos utilizados foram a heteroramnana sulfatada (H), proveniente da macroalga verde Gayralia brasiliensis, e quitosana (Q). A heteroramnana foi obtida a partir da extração aquosa à quente da biomassa algal, e caracterizada por análises químicas e cromatográficas (Cromatografia Líquido-Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas e Cromatografia de Exclusão Estérica de Alta Pressão Acoplada a Detectores de Índice de Refração Diferencial e Espalhamento de Luz Laser em Multiângulos) e métodos espectroscópicos (Ressonância Magnética Nuclear (RMN) 1D e 2D, Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) e RAMAN). A caracterização química e o grau de acetilação da quitosana foram determinados pelas análises de RMN de 1H e 13C. Os hidrogéis foram desenvolvidos por complexação polieletrólito dos polissacarídeos heteroramnana:quitosana, analisando diferentes proporções H:Q. A composição química dos hidrogéis HQ foi avaliada por análises de FTIR, Espectroscopia de Energia Dispersiva (EDS) e RAMAN, demonstrando a presença proporcional dos grupos funcionais -NH2 e -OSO3 -, e sua estabilidade térmica por análises termogravimétricas (TGA). Também foi determinada a capacidade de absorção de fluídos no período de 0,5 até 48 h, verificando-se uma capacidade de retenção de fluídos de 10x em relação à massa inicial. As características ultraestruturais do biomaterial foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), sendo observados dois tipos de estruturas com características distintas, uma lisa homogênea, formada por lamelas sobrepostas, e outra, porosa flocular, formada por poros de diferentes diâmetros. Os hidrogéis (H:Q) 2:1 e 3:2 foram os que demonstraram as melhores características físico-químicas, sendo escolhidos para os ensaios biológicos com células-tronco. A avaliação do biomaterial produzido foi realizada in vitro com células-tronco mesenquimais isoladas do tecido adiposo humano (CTA). As CTA isoladas foram caracterizadas através de imunofenotipagem por citometria de fluxo. Uma vez caracterizadas, as CTA foram cultivadas sobre os hidrogéis nos períodos de 3, 21 e 90 dias, sendo observada a formação de agregados celulares em forma de esferoides. As análises de MEV e imunofluorescência por microscopia confocal a laser demonstraram que as células-tronco foram adsorvidas pelo hidrogel e que a capacidade de proliferação das mesmas foi mantida. A produção de uma extensa matriz extracelular também foi observada e caracterizada por imunofluorescência, evidenciando a presença da proteína de matriz fibronectina. Os hidrogéis produzidos a partir dos polissacarídeos heteroramnana e quitosana demonstram ter características singulares para potenciais aplicações terapêuticas na medicina regenerativa como carreadores de células-tronco e no reparo da matriz extracelular. Palavras-chave: Hidrogel. Heteroramnana. Quitosana. Complexos Polieletrólitos. Células-tronco Mesenquimais do Tecido Adiposo. Esferoide Celular.Abstract: Tissue engineering is a field of regenerative medicine that has been gaining prominence in the development of tissues and organs for transplant using mainly stem cells and biomaterials. The aim of this research was the development of a polysaccharide-made biomaterial and the study of its application in the culture of mesenchymal stem cells. Polysaccharides used were a sulfated heterorhamnan (H), derived from green algae Gayralia brasiliensis, and chitosan (Q). Heterorhamnan was obtained from algal biomass by hot water extraction, characterized by chemical and chromatographic analyses (Gas Chromatography Mass Spectometry and High Performance Liquid Chromatography - Multi Angle Laser Light Scattering - Refractive Index Detector) and spectroscopic methods (1D and 2D Nuclear Magnetic Ressonance (NMR), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and RAMAN). The chemical characterization and acetylation degree of chitosan were defined by 1H and 13C NMR analyses. Hydrogel development was carried out by polyelectrolyte complexation of polysaccharides Heterorhamnan:Chitosan, several H:Q proportions were analyzed. The HQ hydrogels chemical composition was evidenced by FTIR, RAMAN and Energy Dispersive Spectroscopy (EDS) techniques, showing a proportional presence of -NH2 and -OSO3 - functional groups, and the thermal stability by thermogravimetric analysis (TGA). Physico-chemical analyses were accomplished in order to verify the absorption capabilities of fluids in the period of 0.5 to 48 h; showing a retention fluid capacity of 10x. Ultrastructural characteristics of the biomaterial were analyzed by scanning electron microscopy (SEM), and two structures with distinct characteristics were evidenced, a homogeneous smooth structure, composed by superpose lamella, and a floccular porous structure, with pores of different diameter sizes. Hydrogels (H:Q) 2:1 and 3:2 were those that showed the best physico-chemical characteristics and were chosen for the biological assays with stem cells. The biomaterial developed was tested in vitro with mesenchymal stem cell from adipose human tissue (ASC). The isolated ASC were characterized by flow cytometry immunophenotyping. Once characterized ASC were cultivated on hydrogels for 3, 21 and 90 days, being evidenced a cell aggregate formation with spheroidal form. SEM and immunofluorescence confocal laser microscopy analyses showed the adsorption of stem cells into the hydrogel and the proliferation capabilities of cells were maintained. Production of an extensive extracellular matrix was also observed and characterized by immunofluorescence, evidencing the presence of fibronectin matrix protein. Hydrogels prepared from heterorhamnan and chitosan polysaccharides demonstrated singular characteristics with potential therapeutic applications in regenerative medicine for stem cells delivery and extracellular matrix repair. Key-words: Hydrogel. Heterorhamnan. Chitosan. Polyelectrolyte Complex. Adipose Mesenchymal Stem Cell. Cellular Spheroid