Identificação e estudo in vitro da interação entre proteínas PII e proteínas alvo

Orientador : Prof. Dr. Luciano Fernandes HuergoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 09/11/2015Inclui referências : f. 137-154Resumo: As proteínas PII são proteínas transdutoras de sinais, ubíquas em bactérias. Elas estão envolvidas com a regulação do metabolismo de nitrogênio e atuam principalmente por interação direta com proteínas alvo em resposta a ligação dos efetores ATP, ADP e 2-oxoglutarato (2-OG). A ligação de efetores por PII acarreta em alterações conformacionais que refletem diretamente na interação de PII com proteínas alvo. Em Azospirillum brasilense existem duas proteínas PII denominadas GlnB e GlnZ, relacionadas com a ativação transcricional de genes do metabolismo de nitrogênio e regulação pós traducional da nitrogenase em resposta a alteração dos níveis celulares de amônio e 2-OG. Visto que proteínas PII têm a capacidade de sensoriar 2-OG, um metabólito diretamente relacionado ao nível de carbono e nitrogênio celular, é possível que proteínas PII possam desempenhar um papel regulatório no metabolismo de carbono, porém essa hipótese ainda não foi confirmada. Como a atuação de proteínas PII se dá principalmente por interação proteína-proteína, o objetivo deste trabalho foi detectar novas proteínas ligantes das proteínas PII em A. brasilense, para melhor compreender o papel de PII no metabolismo deste organismo. Foram realizados ensaios de interação entre a proteína GlnZ com cauda 6xHis imobilizada em coluna de afinidade e extratos proteicos de A. brasilense 2812 (glnB-/glnZ-), com variação dos efetores ADP, ATP e 2-OG para interação e eluição das proteínas. As proteínas obtidas foram analisadas por espectrometria de massa e classificadas em grupos funcionais. Dentre as proteínas identificadas destacou-se a proteína BCCP (componente da enzima acetil- CoA carboxilase - ACC) por já ter sido descrita por interagir com PII em Arabidopsis thaliana. O gene accB (BCCP) foi clonado do genoma de A. brasilense FP2 e ensaios in vitro foram realizados para caracterização do complexo PII-BCCP. Foram realizados ensaios de atividade com a enzima ACC de Escherichia coli (EcACC) e com proteínas PII de E. coli (EcGlnB), A. brasilense (AbGlnB) e Synechococcus elongatus (SeGlnB) para verificação do efeito de PII na atividade de ACC. Os dados obtidos sugerem uma função conservada de GlnB na regulação da biossíntese de ácidos graxos através de inibição de ACC, uma vez que as proteínas GlnB diferentes organismos foram capazes de inibir a enzima EcACC. O efeito inibitório de EcGlnB e AbGlnB sobre EcACC foi afetado por altas concentrações de 2-OG e por uridililação de PII. Esses dados, juntamente com a análise de variantes de GlnB, sugerem a participação do loop T de GlnB na interação GlnB-ACC. O modelo proposto para a inibição de ACC por GlnB sugere que isso ocorra em baixos níveis de carbono e altos níveis de nitrogênio, quando a concentração de 2-OG é baixa. Além de BCCP, algumas proteínas encontradas nos ensaios de interação têm alta probabilidade de serem alvos de PII. Dentre elas, outras proteínas do metabolismo de ácidos graxos, e proteínas envolvidas com vias metabólicas diversas, como NAD+ sintetase, proteínas do sistema PTS, Glutamato sintase, RelA e RNAses. Os resultados obtidos indicam que em A. brasilense as proteínas PII podem estar atuando na regulação de processo metabólicos diversos.Abstract: PII proteins are signal transducer proteins, ubiquitous in bacteria. They are involved in nitrogen metabolism regulation and act mostly by direct protein-protein interaction in response to effector binding of ATP, ADP and/or 2-oxoglutarate (2-OG). Effectors binding by PII cause conformational changes, which reflect directly on PII interaction with target proteins. In Azospirillum brasilense there are two PII proteins named GlnB and GlnZ, involved with transcriptional activation of nitrogen metabolism genes and nitrogenase post-translational regulation in response to variation of ammonium and 2-OG cellular levels. Since PII proteins are able of sensing 2-OG, which is directly involved with carbon and nitrogen cellular levels signaling, a role in carbon metabolism by PII proteins have been addressed. As PII act by protein-protein interaction, in this study protein interaction assays were performed using a Histagged GlnZ fusion immobilized on a Ni2+-bound resin and a crude extract of A. brasilense strain 2812 (glnB-/glnZ-), using different levels of the effectors ADP, ATP and 2-OG. Protein that were retained by this affinity chromatography were identified by mass spectrometry and classified into functional groups. One of the identified proteins was BCCP protein (component of acetyl-CoA carboxylase or ACC) which interaction with PII has been described earlier in Arabidopsis thaliana. The accB gene (coding for BCCP) was cloned from A. brasilense FP2 genome allowing in vitro assays to be performed in order to characterize PII-BCCP interaction. Enzymatic assays with Escherichia coli ACC and PII proteins from E. coli, A. brasilense and Synechococcus elongatus were carried out to determine the effect of PII on ACC activity. Our data suggested a conserved role of GlnB regulating fatty acids biosynthesis by inhibiting ACC, since GlnB protein from E. coli, A. brasilense, S. elongatus and A. thaliana produced an inhibitory effect on the acetyl-CoA carboxylase activity. 2-OG levels and the uridylylated state of PII affected the inhibitory effect of EcGlnB and AbGlnB on EcACC. These results and assays using GlnB variants suggest involvement of GlnB T loop in the GlnB-ACC interaction. The proposed model for the inhibition of ACC by GlnB suggests that it occurs in low carbon and high nitrogen levels, when the concentration of 2-OG is low. Besides BCCP, some proteins found in interaction assays have a high probability of being the targets of PII. Among these, other proteins from fatty acids metabolism, and proteins involved in various metabolic pathways, like NAD+ synthetase, PTS system proteins, glutamate synthase, RelA and RNAses. The results indicate that in A. brasilense PII proteins can act in the regulation of many metabolic processes