Identificação e caracterização de alfa-e beta-amastinas de Trypanosoma cruzi

Orientador : Prof. Dr. Wanderson Duarte da RochaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 31/03/2016Inclui referências : f. 77-85Resumo: A identificação de genes diferencialmente expressos durante o ciclo biológico de parasitos causadores de patologias é importante na busca por potenciais alvos para o desenvolvimento de vacinas e tratamentos. Trypanosoma cruzi é o agente causador da Doença de Chagas e possui proteínas estágio-específicas que vêm sendo bastante estudadas, como a família das trans-sialidases, as mucinas e as amastinas. Amastinas são proteínas de superfície inicialmente descritas como específicas de formas amastigotas de T.cruzi e Leishmania donovani. A partir de análises in silico de amastinas presentes em diferentes tripanossomatídeos, elas foram classificadas nas subfamílias ?, ?, ? e ?. Para T.cruzi (clone CL Brener), foi estimado um total de 14 cópias de genes de amastinas, dos quais duas ?-amastinas (mais expressas e epimastigotas) e 12 ?-amastinas. Como não se sabe opapel dessas proteínas, a caracterização funcional é um caminho a ser percorrido. Neste trabalho, que está subividido em duas partes principais, os objetivos foram a da caracterização das ?-amastinas através de deleção por recombinação homóloga e a ampliação da identificação de amastinas em T. cruzi. A partir de buscas considerando fragmentos gerados durante o sequenciamento do clone CL Brener, que não foram atribuídos a cromossomos e/ou ORFs não preditas, encontramos sequências ainda não identificadas como amastinas, mas que são semelhantes às amastinas descritas anteriormente. Após análises in silico para presença de domínios, regiões trans membrana, conservação de sequências e organização genômica comparativamente às amastinas previamente descritas em tripanossomatídeos, propomos a presença de ?-amastinas nogenoma de T. cruzi, nomeadas aqui como ?1- e ?2-amastinas. Estas amastinas aparecem em cópia única localizada em região cromossômica diferente das outras amastinas jádescritas em T. cruzi e estão organizadas em sequência. ?1-amastinas têm localização subcelular na superfície do parasito e ?2-amastinas aparecem em regiões pontuais docitoplasma. Sobre a deleção de ?-amastinas, foram construídos e transfectados em CLBrener cassetes para interrupção/bloqueio da expressão desses genes em seu parhomólogo de cromossomos, pela recombinação homóloga desses cassetes. Após integração do primeiro cassete não foram verificadas alterações no crescimento de parasitos transfectados. O segundo cassete de deleção foi transfectado em clones mutantes heterozigotos e após algumas tentativas foi obtida uma população de parasitos estáveis eresistentes aos dois antibióticos. A integração desse segundo cassete foi verificada por PCR,mas também foi observada a presença das regiões codificadoras das ?-amastinas intactasnessa população duplo-resistente, o que sugere que essas amastinas sejam essenciais paraepimastigotas. Apesar de todo conhecimento gerado aqui, mais estudos são necessários para entender as funções dessas proteínas no parasito. Palavras-chave: amastinas, alfa-amastinas, nocaute.Abstract:The identification of differentially expressed genes during T. cruzi life cycle is relevant since they can be potential targets for the development of vaccines and treatments. T. cruzi is the etiological agent of Chagas disease and has stage-specific proteins that have been studied,such as the family of trans-sialidases, mucins and amastins. Amastins are surface proteins initially described as amastigotes specific genes from T. cruzi and Leishmania donovani. Insilico analysis of amastins presented in different trypanosomatids allowed its classification in?, ?, ? and ? subfamilies. T. cruzi (CL Brener clone) was estimated from a total of 14 genecopies of amastins, two of which are ?-amastins (more expressed in epimastigotes) and 12?-amastins. As the role of these proteins are still unknown, the functional characterization iscrucial. Here we improved amastin characterization by studying ?-amastins through deletion by homologous recombination and by identifying new amastin members in T. cruzi. By screening the genomic sequences of CL Brener clone that are poorly explored, the unassigned contigs, sequences encoding new T. cruzi amastins were found. In silico analysis to identify presence of domains, transmembrane regions, and conservation sequences andgenomic organization corroborates the presence of ?-amastins in the T. cruzi genome, name dhere as ?1- and ?2-amastins. Both genes appear as single copy genes located in a distinct chromosome compared to the other amastins described in T. cruzi. The expression of GFP fusion proteins showed that ?1-amastin is targeted to the parasite surface and ?2-amastin is concentrated in specific regions of the cytoplasm. In paralel, we tried to knock out the ?-amastins, two constructs were created and transfected in CL Brener. After deletion using the first allele no changes were observed in the growth curve of transfected parasites. To delete the second allele, the cassette was transfected in heterozygous mutant clones, and after several attempts a double-resistant population of parasites was obtained. The PCR analysis showed the integration of the second cassette at the predicted locus, however intact copies of the coding sequence of both amastins were detected by PCR. These results suggest that?-amastins are essential for epimastigote survival. Depite all efforts described here, a lotmore is needed to define amastin function. Key words: amastin, alpha-amastins, knockou