Desenvolvimento de um controle externo positivo do tipo viral - like - particle para utilização em um teste diagnóstico de arboviroses emergentes

Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio KriegerCoorientadores: Drª. Rita de Cássia Pontello Rampazzo, Profª. Drª. Vanete ThomazSoccolTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa : Curitiba, 22/06/2018Inclui referênciasResumo: Os arbovírus como dengue, Zika e chikungunya têm se proliferado principalmente em regiões tropicais e subtropicais por conta de condições climáticas, ambientais e falta de saneamento. Os sinais e sintomas das arboviroses citadas podem ser bastante semelhantes e representam um problema para o diagnóstico clínico. Assim, o diagnóstico laboratorial é imprescindível para definição das condutas terapêuticas a serem adotadas no tratamento dos pacientes suspeitos. Os testes mais usados no diagnóstico laboratorial são os sorológicos e moleculares, sendo que os testes moleculares apresentam a vantagem de serem mais sensíveis e específicos, enquanto que os sorológicos têm a desvantagem de apresentar riscos de reações cruzadas, uma vez que esses vírus tem genomas bastante semelhantes. O objetivo deste trabalho foi construir um controle externo positivo único contendo sequencias dos arbovírus dengue, Zika e chikungunya e de um transcrito humano específico para validar as reações do kit BIOMOL ZDC. A construção do controle foi feita utilizando técnicas de engenharia genética, foi desenhada uma sequência sintética única contendo fragmentos de todos os alvos do kit, e esta foi sintetizada e clonada em um sistema de expressão conhecido, contendo o promotor T7 e o fago MS2 modificado. Após a expressão e purificação foi feita a extração do RNA das partículas e a amplificação na RT- qPCR. Na análise verificou-se que todos os alvos do kit kit BIOMOL ZDC presentes no controle construído foram amplificados, validando todo o processo desde a extração, a transcrição reversa até a reação de PCR. Portanto, o controle construído atendeu aos objetivos deste projeto e desta forma o kit BIOMOL ZDC que já estava sendo usado para pesquisa no Brasil sem a presença do controle positivo, passou a ser utilizado com o módulo completo pelos mesmos laboratórios que obtiveram resultados semelhantes. Portanto, este produto (kit com o controle), desenvolvido com tecnologia nacional é biosseguro, tendo custo menor e alto valor agregado, e potencial para ser utilizado a fim de atender as necessidades da saúde pública brasileira. Palavras-chave: arbovírus, controle externo, diagnóstico molecular, RTqPCR.Abstract: The arboviruses such as dengue, Zika and chikungunya have proliferated mainly in tropical and subtropical regions due to climatic and environmental conditions and lack of sanitation. The signs and symptoms of the aforementioned arboviruses can be very similar and represent a problem for the clinical diagnosis. Thus, the laboratory diagnosis is essential for defining the therapeutic behaviors to be adopted in the treatment of suspected patients. The most commonly used tests in laboratory diagnosis are serological and molecular tests; molecular tests have the advantage of being more sensitive and specific, whereas serological tests have the disadvantage of presenting cross-reactivity risks, since these viruses have very similar genomes. The objective of this work was to construct a single positive external control containing dengue, Zika and chikungunya arbovirus sequences and a specific human transcript to validate the reactions of the BIOMOL ZDC kit. Construction of the control was done using genetic engineering techniques, a single synthetic sequence containing fragments of all kit targets was drawn and synthesized and cloned into a known expression system containing the T7 promoter and the modified MS2 phage. After the expression and purification, the RNA extraction from the particles and the amplification in the RT- qPCR were made. In the analysis it was verified that all the targets of the BIOMOL ZDC kit present in the constructed control were amplified validating the whole process from the extraction, the reverse transcription until the PCR reaction. Therefore, the constructed control met the objectives of this project and in this way the BIOMOL ZDC kit that was already being used for research in Brazil without the presence of the positive control was used with the complete module by the same laboratories that obtained similar results. Therefore, this product (kit with the control), developed with national technology is biosecure, having a lower cost and high added value, having potential to be used to meet the needs of Brazilian public health. Keywords: arbovirus, external control, molecular diagnosis, RT- qPCR