Strongyloides venezuelensis excretory/secretory products: application to strongyloidiasis diagnosis and characterization of immunoreactive proteins.

Strongyloides venezuelensis EXCRETORY/SECRETORY PRODUCTS: APPLICATION TO STRONGYLOIDIASIS DIAGNOSIS AND CHARACTERIZATION OF IMMUNOREACTIVE PROTEINS. The Human strongyloidiasis is an intestinal parasitosis caused by the nematode Strongyloides stercoralis with worldwide distribution and predominance in tropical and subtropical areas. Parasitological diagnosis presents low sensitivity due to intermittent elimination of larvae in the faeces and approximately 50% of the affected individuals are asymptomatic. In the serological diagnosis, although more sensitive, cross reactivity still occurs with other parasitoses. The search for antigens that present greater specificity, if necessary, and the use of experimental models may aid in the production of heterologous antigens. Strongyloides venezuelensis is often used to evaluate host-parasite interaction, molecular aspects during infection, efficacy of new therapies, and other immunological characteristics of strongyloidiasis. Thus, use of excretory/secretory products (E/S) of filaroid larvae of S. venezuelensis in the diagnosis of strongyloidiasis presents itself as a promising tool. The objective of the research was to obtain E/S products of filaroid larvae of S. venezuelensis, apply them in the diagnosis of strongyloidiasis and to identify and partially characterize the immunoreactive proteins. ELISA tests for anti-Strongyloid IgG were carried out using samples of rat serum experimentally infected with S. venezuelensis or human serum using total saline extract (TS) and E/S products (RPMI E/S and PBS E/S). Immunoblotting was performed to detect the immunoreactive protein fractions and were later analyzed by mass spectrometry and bioinformatics. All preparations detected anti-Strongyloides IgG with emphasis on RPMI E/S (Se = 83.3% and Sp = 100%) on analysis with mouse serum and PBS E/S (Se = 81.7% and Sp = 88.9%) in human serum samples. In immunoblotting, specific protein bands with approximately 17 kDa were identified in the three preparations. In the bioinformatics analysis, proteins containing CAP domain belonging to the superfamily CRISP (A0A0K0FJA1) were identified in the three preparations, in TS a calcium binding protein, RPMI E/S two proteins containing CAP domain and PBS E/S an uncharacterized protein of the family ADF/Cofilin. Most of the identified proteins are E/S products, presenting predicted sequences as B cell epitopes. The E/S products presented superior diagnostic performance to TS, both in experimental and human strongyloidiasis. Protein bands of 17 kDa specific for Strongyloides, presented in their composition, proteins containing CAP domain. The construction of the three-dimensional models of the proteins and their validations were satisfactory and allowed to understand how these proteins present their conformation. Prediction of B-cell epitopes by the Bepipred 2.0 program identified sequences as B-cell epitopes and could be used as possible diagnostic tools as well as in vaccine trials.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorTese (Doutorado)A estrongiloidíase humana é uma parasitose intestinal causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis com distribuição mundial e predominância em áreas tropicais e subtropicais. O diagnóstico parasitológico apresenta baixa sensibilidade devido à intermitente eliminação de larvas nas fezes e por aproximadamente 50% dos indivíduos acometidos serem assintomáticos. O diagnóstico sorológico, apesar de mais sensível, apresenta reatividade cruzada com outras parasitoses. A busca por antígenos que apresentem bons padrões diagnósticos, se faz necessário, e o uso de modelos experimentais podem auxiliar na obtenção de antígenos heterólogos aplicáveis ao diagnóstico. Strongyloides venezuelensis é frequentemente utilizado para avaliar a interação parasito-hospedeiro, os aspectos moleculares durante a infecção, a eficácia de novas terapias e outras características imunológicas da estrongiloidíase. O uso de produtos de excreção/secreção (E/S) de larvas filarioides de S. venezuelensis no diagnóstico da estrongiloidiase, apresenta-se como uma ferramenta promissora. O objetivo da pesquisa foi obter produtos de E/S de larvas filarioides de S. venezuelensis, aplicá-los no diagnóstico da estrongiloidiase e identificar e caracterizar parcialmente as proteínas imunorreativas. Testes ELISA para detecção de IgG anti-Strongyloides foram realizados, com amostras de soro de ratos experimentalmente infectados com S. venezuelensis ou de soro humano, utilizando extrato total salino (TS) e produtos E/S (RPMI E/S e PBS E/S). Immunoblotting foi realizado para detectar as frações proteicas imunorreativas, e posteriormente foram analisadas por espectrometria de massas e bioinformática. Todas as preparações detectaram IgG anti-Strongyloides com destaque para o RPMI E/S (Se = 83,3% e Es = 100%), na análise com soro de rato e PBS E/S (Se = 81,7% e Es = 88,9%) em amostras de soro humano. No immunoblotting foram identificadas bandas proteicas específicas com aproximadamente 17 kDa nas três preparações. Na análise de bioinformática, foram identificadas proteínas contendo domínio CAP pertencente a superfamília CRISP (A0A0K0FJA1) nas três preparações, no TS uma proteína ligante de cálcio, RPMI E/S duas proteínas contendo domínio CAP e PBS E/S uma proteína não caracterizada da família ADF/Cofilin. Em sua maioria as proteínas identificadas são produtos de E/S, apresentando sequências preditas como epítopos de célula B. Conclui-se que os produtos de E/S apresentaram desempenho diagnostico superior ao TS, tanto na estrongiloidiase experimental quanto humana. Bandas proteicas de 17 kDA especificas para Strongyloides, apresentaram em sua composição, proteínas contendo domínio CAP. A construção dos modelos tridimensionais das proteínas e suas validações foram satisfatórias e permitiram entender como essas proteínas apresentam sua conformação. A predição de epítopos de célula B, pelo programa Bepipred 2.0, identificou sequências como epítopos de célula B, podendo serem utilizadas como possíveis ferramentas diagnosticas, como também em testes vacinais