Participación del aminoácido esencial L-Triptófano y su vía catabólica en la infección de la placenta humana por Trypanosoma cruzi

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019La degradación del aminoácido esencial L-Triptófano (Trp) se inicia con la actividad de la enzima indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) y se continúa con la vía de la quinurenina (KP). IDO es altamente expresada en la placenta humana. La depleción local de L-Trp y/o la presencia de metabolitos de la KP, participan en inmunoregulación y pueden ejercer funciones antimicrobianas contra patógenos intracelulares. Se ha descrito que esta vía participa en el control de la replicación de T. cruzi, sin embargo, no ha sido estudiada en el tejido placentario humano infectado por este parásito. En esta tesis nos propusimos analizar la participación de la vía catabólica del L-Trp en la infección de la placenta humana con el agente causal de la transmisión congénita del Chagas. Para ello se utilizó un modelo experimental de infección en explantos de placenta humana a término in vitro y la expresión de proteínas de la vía de la Kyn en placentas a término provenientes de mujeres con enfermedad de Chagas (PEC), como estudio in vivo. Los explantos de vellosidades coriónicas fueron cultivados con 105 tripomastigotes de T. cruzi o sin parásitos (control) en diferentes tiempos de cultivo. Para cada ensayo, se emplearon no menos de 3 placentas distintas. En total se emplearon n = 20 placentas para los ensayos in vitro. A fin de inhibir o estimular la actividad de IDO se utilizaron diferentes compuestos como L-1-Metil-triptófano (L-1MT), Interferón-ɣ (IFN-ɣ) y Trp exógeno. También empleamos metabolitos de la KP como 3-hidroxiquinurenina (3-HK) y ácido 3-hidro antranílico (3-HAA). Se valoraron: Trp por HPLC, producción de Kyn, actividad específica de IDO y carga parasitaria (qPCR) en el explanto después de los diferentes tratamientos. Se utilizó inmunohistoquímica (IHQ) para la determinación de la expresión de proteínas IDO, AhR e IFN-ɣ. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA o prueba “t” de student, utilizando el software GraphPad Prism 7.0. Para evaluar la infección de los explantos se empleó un modelo lineal generalizado para cada una de las variables. Los valores de p < 0.05 fueron considerados significativos. En el transcurso de esta tesis se demostró que a ningún tiempo de cultivo se observarón diferencias significativas tanto en la actividad de IDO como en la expresión relativa de esta enzima entre explantos infectados con respecto a los no infectados. Los niveles de Kyn no se modificaron en explantos infectados respecto al no infectado, sin embargo, las concentraciones de Kyn en explantos infectados se incrementaron significativamente a partir de las 24 h de cultivo. En explantos no infectados se observó 2 un aumento de niveles de Kyn con el tratamiento de IFN-ɣ. La expresión relativa de AhR no se modificó en explantos infectados respecto a no infectados. A los fines de determinar la participación de la actividad de IDO en el control de la infección con este parásito, los explantos placentarios fueron tratados con L-1MT (principal inhibidor específico de la actividad de IDO). En esta tesis demostramos que la inhibición de la actividad de IDO incrementa la carga parasitaria en explantos placentarios, lo que se asoció a una menor concentración de Kyn en el sobrenadante de cultivo. Por otro lado, el tratamiento con IFN-ɣ indujo la actividad de IDO e incrementó las concentraciones de Kyn. El tratamiento con IFN-ɣ en explantos infectados no modificó la carga parasitaria en relación con explanto sin tratamiento, este dato sugiere que las concentraciones basales de IDO encontradas en los explantos placentarios son suficientes para limitar la infección in vitro. Posteriormente se demostró que el agregado de L-Trp exógeno al medio de cultivo aumentó la actividad de la enzima, los niveles de Kyn y colaboró en el control de la replicación parasitaria. Por otro lado, se demostró que los metabolitos de la KP (3-HK y 3-HAA) disminuyeron significativamente la carga parasitaria en los explantos placentarios, sin embargo, solamente 3-HK disminuyó el número de tripomastigotes móviles. Estos datos sugieren que los metabolitos conocidos en conjunto Kyns, podrían estar controlando la replicación del T. cruzi en la placenta. Por último, en PEC a término se observó disminución de la expresión de IDO, AhR e IFN-ɣ mostrando que la vía de la Kyn se modifica en las placentas chagásicas y sugiriendo que podría participar en la infección del tejido placentario por T. cruzi. La disminución de IDO podría tener un efecto semejante al observado en nuestros explantos placentarios tratados con inhibidor de IDO (L-1MT) lo que podría favorecer la infección con T. cruzi en el tejido placentario. Por lo que los resultados obtenidos en esta tesis tanto in vitro como in vivo nos podrían ayudar a comprender mejor cómo la placenta estaría controlando la infección por T. cruzi a través de la vía catabolitca del L-Trp por la generación de metabolistos y de esta manera, colaborar en la prevención de la transmisión congénita de Chagas. 3 Palabras claves: Trypanosoma cruzi, placenta humana, Triptófano, Indoleamina 2,3-dioxigenasa, quinureninas, 3-HK, 3-HAA202