Magnetic resonance studies of cereal proteins and some solid model systems

The main aim of the present work is to contribute to the knowledge of the structure of wheat proteins through the application of spectroscopic techniques in the solid state. High molecular weight (HMW) gluten proteins are the most important components in determining the functional properties of wheat flour, since, when hydrated, they confer the well known and very important visco-elasticity to dough. Chapter I of this thesis summarises the present knowledge about wheat components giving particular emphasis to the structure and functionality of the protein fraction. Chapter II describes shortly the fundamentals and methods of solid state NMR and ESR spectroscopy, in particular the theory underlying the experiments that were carried out in this work (1H and 13C NMR and spin probe ESR). Chapter III presents a 13C and 1H NMR study of the structural and dynamic changes in a purified wheat HMW glutenin subunit (the alkylated 1Dx5 or alk1Dx5) upon hydration. The 13C NMR study allows the hydration of the subunit to be followed in terms of conformational and mobility changes. The use of 1H high resolution (HR) MAS techniques on the hydrated protein enabled, for the first time, 2D NMR methods to be employed on these type of proteins in the semi-solid state, thus allowing the assignment of the 1H NMR spectrum to be achieved in terms of amino acid type and to obtain information on the predominant conformations of the hydrated protein. The 1H NMR spectrum of the 1Dx5 subunit proved also to be very sensitive to structural changes upon heating, i.e. in conditions that mimic the baking process. In Chapter IV solid state NMR techniques are applied to model systems derived from the primary structure of the 1Dx5 subunit in order to understand the role of 1) disulphide bonds, 2) irregular amino acid sequences at the terminal ends, 3) chain length and 4) system heterogeneity, on the response of 1Dx5 subunit to hydration. The formation of a network based on the 'loop and train' theory seems consistent with the results obtained. It is suggested that junction zones bring together the segments comprising the nonapeptide repetitive peptides and irregular chain sequences whereas the loop segments may comprise the hexa- and tripeptide repetitive sequences. Chapter V is focused on the study of hydration of individual glutenin subunits (1Dx5, 1Dx2, 1Dy10 and 1Dy12) and pairs of subunits (1Dx5+1Dy10, 1Dx2+1Dy12) in order to detect eventual differences which may form the basis of the different well-known technological performances of selected HMW subunits. Some discriminations between good and poor breadmaking quality subunits are found in terms of protein conformation and dynamics. Chapter VI extends the application of 1H NMR to the more complex system of gluten. In particular, the behaviour of hydrated glutens from a soft and a hard flour upon heating are compared. The major changes involve the starch matrix and the water molecules whereas the protein fraction is affected to a less extent by heating, as viewed by 1H MAS NMR. In Chapter VII the complexity of the system under study is increased and the behaviour of dough components upon heating is investigated by spin probing ESR. Starch and lipid behaviours are monitored through the changes of the rotational correlation times of spin probes for different (pseudo)cereals (maize, sorghum and quinoa). The last two chapters refer to specific problems of solid state NMR and the results obtained may be eventually applied to the study of cereal proteins or other biopolymers. A systematic investigation of the dependence of 1H T1 of adamantane and glycine with MAS spinning speed is carried out in Chapter VIII. Naturally, this dependence is found to be different depending on the type of solid under study. The interpretation of the dependence of 1H T1 on spinning rate takes into account some factors such as proton density, intrinsic molecular motion and in particular the heating of the sample by the friction between the rotor and the bearing gas, effect especially important at very high spinning rates (up to 32 kHz). Finally, Chapter IX takes into account a recent new acquisition method that allows resolved 1H NMR spectra of solids to be recorded. This method employs a single pulse excitation followed by a long delay before data acquisition and it was combined in this work with Fast-MAS (up to 32 kHz) in order to obtain 1H NMR spectra of improved resolution of simple amino acids in the dry state. Also, the effect of some factors such as drying conditions, sample crystallinity and temperature on the resolution of the 1H spectra were investigated. This method was then extended to alk1Dx5 in order to investigate the potential resolution and information obtainable about complex systems such as a cereal proteins.Com o presente trabalho pretende-se contribuir para uma melhor compreensão da estrutura das proteínas do trigo, recorrendo a técnicas espectroscópicas de estado sólido. As proteínas de elevado peso molecular do glúten são os componentes mais relevantes na determinação das propriedades funcionais da farinha uma vez que estas proteínas, quando hidratadas, desempenham um papel determinante nas propriedades viscoelásticas da farinha. No Capítulo I, desta tese, é descrita a composição do trigo, dando especial ênfase à estrutura e funcionalidade da fracção proteica. O Capítulo II descreve, de uma forma resumida, os fundamentos e os métodos de espectroscopia de NMR e ESR de estado sólido, em particular a teoria subjacente às experiências empregues no decorrer desta tese. No Capítulo III é apresentado um estudo de RMN de 1H e 13C referente às modificações estruturais e de dinâmica sofridas por uma subunidade proteica de elevado peso molecular purificada a partir do trigo (1Dx5 alquilada ou alk1Dx5) como resultado da hidratação. A técnica de 13C RMN permite seguir as alterações conformacionais e de mobilidade sofridas pela subunidade proteica aquando da sua hidratação. A aplicação de técnicas de RMN de protão de alta resolução (HR-MAS) à subunidade 1Dx5 permitiu, pela primeira vez, o uso de métodos bidimensionais de RMN no estudo deste tipo de proteínas no estado semi-sólido. Desta forma conseguiu atribuir-se a cada pico do espectro de protão o aminoácido correspondente e obter informação sobre as comformações predominantes no estado hydratado da proteína. O espectro de 1H RMN da subunidade 1Dx5 mostrou ser bastante útil na determinação de alterações estruturais ocasionadas pelo tratamento térmico; esta aplicação poderá ser extremamente relevante no estudo do processo de panificação. No Capítulo IV foram aplicadas técnicas de RMN de estado sólido a sistemas modelo derivados da estrutura primária da subunidade 1Dx5. Este estudo teve como objectivo compreender melhor o papel que desempenham, neste tipo de proteínas, 1) as pontes dissulfeto, 2) as sequências irregulares de aminoácidos dos domínios terminais da proteína, 3) o comprimento da cadeia e 4) a heterogeneidade do sistema, aquando a hidratação das proteínas. Os resultados obtidos com este estudo parecem consistentes com a formação duma rede proteica baseada na teoria de 'loops and trains' e sugerem que os nonapeptídios e as sequência irregulares presentes na cadeia estejam preferencialmente envolvidas nas zonas correspondentes a 'trains', enquanto que os hexapeptídios e tripeptídios se encontram preferencialmente nas zonas correspondentes a 'loops'. O Capítulo V descreve um estudo de hidratação aplicado a subunidades de gluteninas purificadas (1Dx5, 1Dx2, 1Dy10 e 1Dy12) e a misturas das referidas subunidades (1Dx5+1Dy10, 1Dx2+1Dy12). Este estudo serviu para se proceder ao levantamento de eventuais diferenças que poderão estar na base de tão distintos comportamentos das subunidades de elevado peso molecular face à panificação. Conseguiu-se, assim, a distinção em termos estructurais e dinamicos entre subunidades que apresentam boas características para panificação e as que apresentam fracas características para panificação. O Capítulo VI estende a aplicação de RMN do protão ao um sistema mais complexo – o glúten. Assim, foi estudado o comportamento de glutens, extraídos de farinhas 'soft' e 'hard', face a tratamentos térmicos. Estudos de 1H MAS RMN aplicados às referidas amostras de glúten mostraram que as alterações mais relevantes são as sofridas pela matriz amilácea e pelas moléculas de água; a fracção proteica mostrou sofrer menos alterações com o tratamento térmico. No Capítulo VII a complexidade do sistema estudado foi ainda incrementada, desta vez estudando, por espectroscopia de ESR, o comportamento da farinha face a tratamento térmico. O comportamento de amido e lípidos, de dois cereais (milho e sorgo) e de um pseudocereal (quinoa), foi seguido através das alterações de tempos de correlação rotacional de sondas paramagnéticas. Os dois últimos capítulos referem-se a problemas especificos do estudo de sólidos por espectroscopia RMN. Os resultados obtidos poderão ser aplicados as sistemas de maior complexidade como proteínas de cereais ou outros biopolímeros. No Capítulo VIII procedeu-se ao estudo sistemático da dependência de 1H T1 com a velocidade de rotação (MAS), tendo como modelos adamantano e glicína. Esta dependência varia naturalmente com o sólido estudado. A interpretação de tal dependencia deverá ter em conta factores como a densidade protónica e a dinâmica molecular, assim como o efeito do aquecimento devido à fricção entre o rotor e o gás de arrastamento, particularmente relevante a altas velocidade de rotação. Por fim, no Capítulo IX, são apreentadas algumas aplicações de um novo método que permite obter uma melhor resolução de espectros de 1H de sólidos e que utiliza uma excitação de pulso único seguida de um tempo de espera longo. Nesta tese, este método foi combinado com MAS a altas velocidades de rotação (Fast-MAS) de modo a obter espectros de 1H de alta resolução de amino acidos no estado seco. O efeito de alguns factores, tais como as condições de secagem e a cristalinidade das amostras e o aumento da temperatura foram estudados. Este método foi aplicado também a alk1Dx5 de modo a mostrar a potential resolução obtenivel em sistemas complexos como as proteínas de cereais.Programa Doutoral em Químic