Cultivo de fungos comestíveis: estudos com espécies saprófitas e ectomicorrízicas

Os fungos comestíveis são apreciados um pouco por todo o mundo devido ao seu elevado sabor e valor nutricional. Estes podem ser colhidos na natureza, estando sujeitos à sazonalidade, ou produzidos em condições controladas, estando assim disponíveis durante todo o ano. A produção da espécie saprófita Macrolepiota procera e das espécies ectomicorrízicas Boletus edulis, B. fragrans, Hydnum repandum, Tricholoma equestre e T. portentosum são de particular interesse não só devido ao seu potencial gastronómico, mas também como importante fonte de rendimento económico. Além disso, é de todo relevante a exploração de grandes áreas florestais dominadas por Eucaliptus globulus, espécie exótica em Portugal, com vista à produção de cogumelos e consequente maximização do seu rendimento. O principal objetivo desta dissertação é o estudo da produção de cogumelos comestíveis, incluindo espécies ectomicorrízicas e saprófitas. Desta forma, estudou-se e reportou-se pela primeira vez a associação ectomicorrízica de grande potencial económico entre H. repandum e E. globulus, em condições naturais; realizaram-se ensaios in vitro tendo em vista a exploração dos potenciais simbiontes ectomícorrizicos comestíveis de E. globulus; e otimizaram-se as condições de cultura de M. procera visando alcançar-se a produção de corpos frutíferos. Foram analisadas amostras de solo colhido 5 cm abaixo do corpo frutífero de H. repandum em plantações de E. globulus. As micorrizas encontradas foram separadas, classificadas em grupos morfológicos e identificadas molecularmente através da amplificação e sequenciação da região ITS (Internal Transcribed Spacer) confirmando-se assim a presença de H. repandum associado às raízes de E. globulus. As micorrizas de H. repandum foram caracterizadas morfológica e anatomicamente através da análise de ectomicorrizas frescas à lupa, assim como de cortes resultantes de impregnações em parafina e em resina ao microscópio. As micorrizas observadas apresentavam um sistema de ramificação monopodial-piramidal, com as extremidades não ramificadas dobradas, cor laranja esbranquiçadas e pontas brancas. Anatomicamente apresentavam uma rede de Hartig cortical, como é característico desta espécie fúngica com outros parceiros vegetais. Para os ensaios in vitro com E. globulus foram testados quatro protocolos de esterilização e de germinação de sementes. Como potenciais simbiontes ectomicorrízicos utilizaram-se os fungos comestíveis - Boletus edulis, B. fragrans, H. repandum, Lactarius deliciosus, Tricholoma equestre e T. portentosum - e, como controlo positivo, Pisolithus tinctorius. As culturas de micélio foram colocadas a crescer em caixas de Petri com meio Potato Dextrose Agar (PDA) e para o aumento de escala foram utilizados balões de Erlenmeyer de 50 mL, com 30 mL de meio líquido Biotin-Aneurin-Folic Acid (BAF). Foram otimizadas através do uso de diversos substratos (composição e percentagens) as condições de crescimento de E. globulus. Para a síntese das ectomicorrizas foram testados três métodos de inoculação distintos – inóculo líquido, inóculo esporal e soil traps. Ao longo de todo este ensaio foram efetuados três momentos de avaliação às partes aérea e radicular das plantas. Os ensaios de síntese in vitro de micorrizas de E. globulus com diversas espécies de fungos comestíveis e através de métodos de inoculação distintos, não tiveram sucesso. Apesar disso, foi aperfeiçoada uma metodologia de micorrização em condições controladas através da seleção do melhor protocolo de esterilização e germinação de sementes, tal como da melhor composição e percentagens de substratos para o crescimento de E. globulus. Para a otimização da produção de spawn de M. procera foram ensaiadas três misturas de substratos de aveia e trigo - 100 % aveia, 100 % trigo e 70 % aveia + 30 % trigo. Foram utilizados dois tipos de contentores distintos para o embalamento de três substratos de produção de cogumelos - folhas de carvalho + estrume de cavalo, palha de trigo + estrume de cavalo e palha de arroz + estrume de cavalo - todos com pesos iguais (1:1). Na tentativa de induzir a formação de corpos frutíferos foram aplicados diversos estímulos, como a aplicação inicial de cinco receitas de terra de cobertura seguido de dois tratamentos distintos - com e sem refrigeração - entre outros. O crescimento da spawn na mistura 70 % aveia + 30 % trigo revelou ser ideal para um desenvolvimento rápido e saudável do micélio de M. procera. Embora com pequenas variações, todos os substratos de produção de cogumelos foram altamente colonizados pelo fungo. Não se formaram cogumelos após a aplicação dos diversos estímulos de indução da formação de corpos frutíferos. No entanto, nos substratos cuja terra de cobertura era à base de manta morta que não sofreram estímulo de refrigeração, obtiveram-se pequenas massas densas de hifas, semelhantes às estruturas que originam os corpos frutíferos na natureza. Este trabalho veio acrescentar novos conhecimentos de extrema importância para o desenvolvimento de novos protocolos de produção de cogumelos comestíveis assim como para a exploração de novas associações micorrízicas de grande interesse económico e biotecnológico.Edible fungi are appreciated all over the world due to their high taste and nutritional value. These fungi may be harvested in nature, being subject (subjected)) to seasonality, or produced under controlled conditions, being available throughout the year. The production of saprophyte species Macrolepiota procera and the ectomycorrhizal species Boletus edulis, B. fragrans, Hydnum repandum, Tricholoma equestre and T. portentosum are of particular interest not only because of their gastronomic potential but also as an important source of economic yield. In addition, the exploration of large forest areas dominated by Eucalyptus globulus, an exotic species in Portugal, in order to produce mushrooms and consequent maximization of their yield is of great relevance. The main objective of this dissertation is the study of the production of edible mushrooms, including ectomycorrhizal and saprophytic species. In this way, the ectomycorrhizal association of great economic potential between H. repandum and E. globulus was studied and reported for the first time under natural conditions; In vitro assays were carried out in order to explore the potential edible ectomycorrhizal symbionts of E. globulus; and M. procera culture conditions were optimized in order to reach the production of fruiting bodies. Soil samples harvested 5 cm below the fruiting bodies of H. repandum in E. globulus plantations were analyzed. The mycorrhizae were separated, classified into morphological groups and molecularly identified through the amplification and sequencing of the ITS (Internal Transcribed Spacer) region, thus confirming the presence of H. repandum associated with E. globulus roots. The mycorrhizae of H. repandum were characterized morphologically and anatomically through the analysis of fresh ectomycorrhizae with the stereo microscope as well as cuts resulting from impregnations in paraffin and resin under a microscope. The observed mycorrhizae showed a monopodialpyramidal ramification system, with the unramified ends bent, whitish orange color and white tips. Anatomically, they presented a cortical Hartig network, as generally observed in the relation of this fungal species with other plant partners. Four protocols for sterilization and seed germination were tested for in vitro tests with E. globulus. As potential ectomycorrhizal symbionts were used the edible fungi species - Boletus edulis, B. fragrans, H. repandum, Lactarius deliciosus, Tricholoma equestre and T. portentosum - and as a positive control, Pisolithus tinctorius. Mycelial cultures were grown in Petri dishes with Potato Dextrose Agar (PDA) medium and for scaling up, 50 ml Erlenmeyer flasks were used with 30 ml of Biotin-Aneurin-Folic Acid liquid medium (BAF). The growth conditions of E. globulus were optimized through the use of several substrates (composition and percentages). For the synthesis of ectomycorrhizas three different inoculation methods were tested - liquid inoculum, spore inoculum and soil traps. Throughout this essay, three evaluation moments were made to the aerial and root parts of the plants. The in vitro synthesis of E. globulus mycorrhizae with several species of edible fungi and by different inoculation methods was not successful. Despite this, a methodology of mycorrhization under controlled conditions was perfected through the selection of the best protocol for sterilization and seed germination, such as the best composition and percentages of substrates for the growth of E. globulus. For the optimization of spawn production of M. procera, three mixtures of oats and wheat substrates were tested - 100 % oats, 100 % wheat and 70 % oats + 30 % wheat. Two different container types were used for the packaging of three mushroom production substrates - oak leaves + horse manure, wheat straw + horse manure and rice straw + horse manure - all with equal weights (1: 1). In the attempt to induce the formation of fruiting bodies, several stimuli were applied, such as the initial application of five casing layers recipes followed by two different treatments - with and without refrigeration - among others. The spawn growth in the 70 % oat + 30 % wheat mixture proved to be ideal for a rapid and healthy development of M. procera mycelium. Although with slight variations, all the substrates of mushroom production were highly colonized by the fungus. Mushrooms were not formed after the application of the various inducing stimuli of the formation of fruiting bodies. However, on substrates whose casing layer was leaf litter that did not undergo refrigeration stimulation, small dense masses of hyphae were obtained, similar to the structures that give rise to the fruiting bodies in nature. This work has added new knowledge of extreme importance for the development of new protocols for the production of edible mushrooms as well as for the exploration of new mycorrhizal associations of great economic and biotechnological interest.Mestrado em Biotecnologi