Influência de isoformas de laminina na mecanobiologia de oligodendrócitos

Uma característica proeminente do desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC) dos vertebrados é a mielinização, um processo realizado por oligodendrócitos (OLs), amplamente dispersos por todo o SNC adulto. Evidências crescentes sugerem que a composição e as propriedades mecânicas da MEC (rigidez, elasticidade e topografia) regulam vários aspetos da biologia de OLs. Estudos anteriores revelaram que as proteínas da MEC, como a fibronectina (FN) ou a vitronectina (VN) estão envolvidas na proliferação e manutenção de células percursoras de oligodendrócitos (OPCs), enquanto que a laminina-2/merosina (LM-211/MN) promove a sua diferenciação em OLs maduros. Evidências recentes do nosso laboratório sugerem o aumento da diferenciação e maturação de OLs in vitro com a utilização de substratos que mimetizam o ambiente nativo de OLs (a gama de rigidez do cérebro varia entre 0,1 e 10 KPa) e a potenciação do seu efeito pela presença de MN. No entanto, as proteínas da membrana basal, incluindo a própria MN, são frequentemente difíceis de obter na forma nativa e em quantidades suficientes a partir de tecidos e, desta forma, a produção recombinante tornou-se uma abordagem alternativa valiosa. Além de serem mais económicas, as proteínas recombinantes possuem ainda a vantagem de terem composição bem definida, em contraste com a MN purificada a partir de placenta humana que tem por base uma composição mal definida, apresentando uma mistura de proteínas de MEC. Este trabalho tem como principal objetivo elucidar o papel da mecanotransdução e de proteínas da MEC (especificamente as lamininas) na diferenciação de OLs, com vista a determinar o seu potencial para serem utilizadas no futuro em substituição às proteínas humanas purificadas tradicionalmente utilizadas, incluindo a FN e MN, correlacionadas com a manutenção de OPCs e diferenciação em OLs maduros, respetivamente. Com vista à otimização da plataforma de diferenciação da linha celular oligodendrócito-tipo 2-astrócito (CG-4) estabelecida por Lourenço et al., 2016, substratos de 6,5 kPa foram funcionalizados com três lamininas recombinantes (LM-211, LM-411 e LM-521), descritas na literatura como sendo expressas no SNC (como a LM-211 e LM-521) e/ou com funções importantes no SNC (como a LM-211, LM-411 e LM-521), envolvidas na regulação de OLs (como a LM-211) ou por interagirem com integrinas essenciais à biologia de OLs, incluindo α6β1 e αvβ3. Procurámos ainda, avaliar o papel das integrinas α6β1 e αvβ3 na diferenciação de culturas oligodendrocíticas. Para tal, procedemos a um ensaio de bloqueio de função das subunidades β1 e β3 de integrina, afim de perceber o seu efeito na diferenciação da linha celular em estudo. Os nossos resultados sugerem que a utilização de substratos de poliacrilamida com módulo de Young de 6,5 kPa funcionalizados com LM-521 ou LM-521+PDL representam uma plataforma de diferenciação eficiente, e desta forma propomos que a proteína recombinante LM-521 possa ser utilizada no futuro como alternativa à MN humana purificada, facilitando a geração de OLs maduros.A prominent feature of vertebrate central nervous system (CNS) development is the myelination, a process performed by oligodendrocytes (OLs), widely scattered throughout the adult CNS. Increasing evidence suggests that the composition and mechanical properties of ECM (stiffness, elasticity and topography) regulate various aspects of the biology of OLs. Previous studies have proved that ECM proteins, such as fibronectin (FN) or vitronectin (VN), are involved in the proliferation and maintenance of oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), while laminin-2/merosin (LM-211/MN) promotes their differentiation in mature OLs. Recent in vitro evidences from our lab suggest an increase in the differentiation and maturation of OLs with the use of substrates that mimic the native environment of OLs (the range of stiffness of the brain varies between 0.1 and 10 KPa) and the potentiation of its effect by the presence of MN. However, basement membrane proteins, including MN itself, are often difficult to obtain in their native form and in sufficient amounts from tissues, and thus recombinant protein production has become a valuable alternative approach. In addition to being more economical, recombinant proteins have the advantage of having well-defined composition, in contrast to MN, which is purified from human placenta, being poorly defined and presenting a mixture of ECM proteins. This work’s main objective is to elucidate the role of mechanotransduction and ECM proteins (specifically laminins) in the differentiation of OLs, in order to determine their potential to be used in the future in replacement to the traditionally used purified human proteins, including FN and MN, correlated with maintenance of OPCs and differentiation in mature OLs, respectively. In order to optimize the differentiation platform of the oligodendrocyte-type 2-astrocyte cell line (CG-4) established by Lourenço et al., 2016, 6.5 kPa substrates were functionalized with three recombinant laminins (LM-211, LM-411 and LM-521), described in the literature as being expressed in the CNS (such as LM-211 and LM-521) and/or with important functions in CNS (such as LM-211, LM-411 and LM-521), involved in the regulation of OLs (such as LM-211) or by interacting with essential integrins in the biology of OLs, including α6β1 and αvβ3. We also tried to validate the role of α6β1 and αvβ3 integrins in the differentiation of oligodendrocyte cultures. To do this, we performed a function-blocking assay of β1 and β3 integrin subunits, in order to understand its effect on differentiation of the cell line under study. Our results suggest that the use of 6.5 kPa polyacrylamide substrates functionalized with LM-521 or LM-521+PDL represent an efficient differentiation platform and, hence we propose that the recombinant protein LM-521 can be used in the future as an alternative of great relevance to purified human MN, facilitating the generation of mature OLs.Mestrado em Biologia Molecular e Celula