Estudo bioquímico de videiras in vitro infectadas com Phaeomoniella chlamydospora e Phaeoacremonium angustius e caracterização dos microrganismos envolvidos na doença

Vários fungos tem sido associados a esca da videira, desconhecendo-se contudo, o seu modo de acção. Phaeoacremonium e Phaeomoniella são dois géneros de fungos filamentosos que têm sido associados a esta complexa doença. Os mecanismos que medeiam a infecção e o desenvolvimento destes fungos nas videiras ainda não estão definidos. Para um melhor entendimento da virulência das estirpes procedeu-se a um estudo das capacidades enzimáticas de Phaeoacremonium angustius e Phaeoacremonium chlamydospora. Num rastreio preliminar, observou-se que tanto P. angustius como P. chlamydospora produzem amilase, celulase, protease, poligalacturonase, fosfatase, urease e lipase. Adicionalmente P. angustius produz lacase da lenhina e liase do pectato. P. angustius apresentou actividade enzimática mais intensa que P. chlamydospora. Posteriormente inocularam-se videiras e tecido caloso, in vitro, com suspensões de esporos de diferentes estirpes de P. chlamydospora e P. angustius. Para este fim utilizaram-se duas casta de Vitis vinifera L.: Baga e Maria Gomes e ainda um porta enxertos. Em ambas as castas observou-se que a inoculação com suspensão de esporos causou uma influência negativa no crescimento assim como degradação membranar, revelada por um aumento da produção de MDA. A estirpe CAP054 parece ter causado o efeito mais nefasto. Quanto à infecção das plantas observou-se que nas plantas inoculadas houve uma redução do teor de clorofila (a e b), aumento da permeabilidade membranar e diminuição da razão Fv/Fm (o que sugere perda de funcionalidade do Fotossitema II). As plantas de porta enxertos mostraram ser, em geral, menos afectadas pela infecção. Verificou-se ainda diferentes graus de virulência entre os isolados. Quando se inoculou tecido caloso com filtrado de cultura líquida de Phaeoacremonium e Phaeomoniella, este desenvolveu uma cor acastanhada e sofreu redução da taxa de crescimento. Esta redução foi mais evidente na casta Maria Gomes. O filtrado da estirpe CAP054 causou os efeitos mais nefastos em relação à taxa de crescimento, enquanto o isolado 1AS induziu a produção de MDA mais elevada, sugerindo uma forte degradação membranar. Tradicionalmente o controlo da esca é feito pela aplicação de arsenito de sódio (NaAsO2), um composto extremamente tóxico. Devido à sua elevada toxicidade é urgente encontrar um tratamento alternativo ao arsenito de sódio. Neste estudo comparou-se a resposta de Phaeomoniella e Phaeoacremonium ao arsenito de sódio com a sua resposta a outros dois pesticidas de toxicidade ligeira: o tiabendazol e o ziram. O efeito dos três compostos foi estudado medindo a área das colónias, mantidas em meio agarizado contendo os pesticidas. O tiabendazol inibiu o crescimento das colónias tendo este efeito sido mais evidente para concentrações iguais ou superiores a 0,3 ?M. Os resultados sugerem que o tiabendazol poderá ser uma boa alternativa ao arsenito de sódio. Estudou-se também a resposta de Phaeoacremonium e Phaeomoniella ao resveratrol, uma fitoalexina produzida pelas videiras, tendose observado uma forte diminuição de crescimento das colónias na presença de resveratrol, na concentração 876,0 ?M. Posteriormente cultivaram-se videiras (infectadas e não infectadas) em meio de cultura adicionado com tiabendazol e tecido caloso em meio de cultura adicionado com tiabendazol, arsenito de sódio e resveratrol. As plantas infectadas na ausência de tiabendazol desenvolveram sintomas de senescência bastante evidentes (aumento da produção de MDA, decréscimo do teor de clorofila e perda de eficiência fotossintética). As plantas infectadas na presença de 30 ?M de tiabendazol não apresentaram diferenças notórias em relação as plantas controlo no que respeita a produção de MDA, eficiência fotossintética e teor em clorofila, o que sugere um efeito positivo do tiabendazol nas plantas infectadas, minimizando os efeitos de senescência causados pela infecção. Quanto ao tecido caloso observou-se um efeito positivo do resveratrol, na concentração 876,0 ?M assim como do tiabendazol na concentração 30 ?M.Many fungal species have been associated with esca syndrome, however, their mode of action is still unknown. Phaeomoniella and Phaeoacremonium are two genus of filamentous fungus that have been associated with this complex disease. The mechanisms that mediate the infection and the development of these fungi in the grapevines are not defined yet. In order to understand the virulence of different strains we assessed the extracellular enzymatic capacities of Phaeoacremonium angustius e Phaeomoniella chlamydospora. It was found that all strains produced amylase, cellulase, protease, polygalacturonase, phosphatase, urease and lipase. Additionally P. angustius produced lignin laccase and pectate lyase. Globally P. angustius showed higher enzymatic activity than P. chlamydospora. Afterwards calli and in vitro grapevines were inoculated with spore suspensions of different P. chlamydospora e P. angustius strains’. They were used three cultivars for the experiment with plants: Maria Gomes, Baga and one rootstock. For calli experiments were used two cultivars: Maria Gomes and Baga. For calli infection it was observed that the inoculation with spore suspension caused a negative influence on growth and on membranar degradation, revealed by an increase of MDA production. The strain CAP054 seems to have the strongest effect. In relation to plant infection, we observed that in infected plants there was a reduction in chlorophyll (a and b) content, increase in membranar permeability and decrease in Fv/Fm (which suggests lost in functionality of photosystem II). The rootstock was less affected by the infection. They were verified different virulence levels among the isolates. When callus was inoculated with liquid culture’s filtrate of Phaeoacremonium and Phaeomoniella, it developed a brownish coloration and its growth rate was decreased. This reduction was more evident in Maria Gomes cultivar. CAP054 (P. angustius) filtrate caused the strongest effects on growth rate whereas 1AS (P. chlamydospora) filtrate induced the highest MDA production, suggesting intense membranar degradation. Traditionally the control of esca is done by sodium arsenite application (NaAsO2), an extremely toxic compound. Due to its high toxicity it is urgent to find an alternative treatment to sodium arsenite. In this study the response of Phaeomoniella e Phaeoacremonium to sodium arsenite were compared with the response to thiabendazole and ziram. This effect was studied measuring colony areas of the fungi kept in medium where the pesticide was incorporated. Thiabendazole inhibited colony growth, with a highest effect for concentrations equal or superior to 0,3?M. The results suggest that thiabendazole can be a good alternative to sodium arsenite. It was also studied the response of this fungi to resveratrol, a phytoalexin produced by grapevines. It was observed a strong decrease in colony growth for resveratrol at the concentration 867,0 ?M. Afterwards infected and non-infected grapevines were grown in culture media added with thiabendazole. Calli were grown in culture media added with thiabendazole, sodium arsenite and resveratrol. Infected plants in absence of thiabendazole developed evident senescence symptoms (increase in MDA production, decrease in chlorophyll content and loss of photosynthetic efficiency). Infected plants in presence of thiabendazole at 30 ?M didn’t show notorious differences in relation to those non infected, in MDA production, photosynthetic efficiency and chlorophyll content This results suggest that thiabendazole has a positive effect in the infected plants, minimising senescence symptoms caused by infection. In relation to calli it was observed a positive effect for those grown in medium added with resveratrol (876?M) and with thiabendazole at 30 ?M.Mestrado em Toxicologia e Ecotoxicologi