Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence : fluidité membranaire et détection de molécule unique en solution concentrée

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a single molecule technique very well suitedfor in vivo studies. We have used FCS to explore plasma membrane microfluidity of livingcells. Measurements were conducted at the single cell level, which enabled us to get a detailedoverview of the typical plasma membrane microviscosity distribution of each cell line studied(LR73, MCF7, KB3.1, MESSA and MDCKII). A Monte Carlo simulation based on a 2Ddiffusion model enables us to link the asymetric fluidity distribution profile with the plasmamembrane micro-organization. This result was used to determine the membrane organisationrelated to the surexpression of the P-glycoprotein (Pgp), a protein implicated in multidrugresistance. We also compare the membrane structuration of various cancer cell lines, eachcomes in two versions, a sensitive one and a resistant one to a chemotherapeutic drug : theDoxorubicin.Secondly, we propose a new excitation scheme based on a nonradiative energy transfert.This approach allow us to reduce the illumination depth of the microscope at the nanometricscale. We demonstrate its potential through two applications : FCS in micromolar solutionsand fluorescence imaging on cells adhesion areas.La Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence (FCS) est une technique de moléculesuniques particulièrement bien adaptée aux études en milieu biologique. Elle est ici mise enoeuvre pour analyser localement la membrane plasmique de cellules vivantes. Dans un premiertemps, la distribution de la microfluidité membranaire de cellules vivantes a été caractériséegrâce à des mesures de temps de diffusion par FCS. Nous avons ainsi pu établir la loi dedistribution de la fluidité membranaire à l’échelle de la cellule unique pour différentes lignéescellulaires (LR73, MCF7, KB3.1, MESSA et MDCKII). Une simulation Monte-Carlo montrequ’un modèle simple de diffusion à deux dimensions dans une matrice contenant des microdomainesvisqueux peut rendre compte de l’allure asymétrique typique des distributions obtenues.Ce résultat a été utilisé pour évaluer les modifications membranaires liées à la surexpressionde la P-glycoprotéine, protéine responsable d’un phénomène de résistance à la chimiothérapie.Nous avons également comparé la structuration membranaire de diverses lignées cancéreuses,chacune se déclinant en une version sensible et une version résistante à un médicament : laDoxorubicine.Dans un second temps, nous proposons une nouvelle méthode d’illumination locale baséesur un transfert d’énergie non radiatif. Cette méthode permet de réduire la profondeur dechamp du microscope à l’échelle nanométrique. Nous en démontrons ici le potentiel pourl’utilisation de la FCS dans des solutions micromolaires ainsi que pour l’imagerie de l’adhésioncellulaire