Entomopathogenic viruses of Culicidae: diversity, pathology, transmission and host range

Es de público conocimiento la importancia cada vez mayor que tienen los mosquitos como vectores de enfermedades del hombre y de los animales domésticos, considerando que las enfermedades transmitidas por ellos representan más del 17% de todas las enfermedades infecciosas y provocan cada año, más de 1 millón de defunciones. Se hace evidente la necesidad de métodos de control de vectores más eficaces que los empleados hasta ahora. Un mayor conocimiento en este sentido, nos ayudará a evaluar nuevas perspectivas para el control de los mosquitos desde el punto de vista del Manejo Integrado.Los insecticidas químicos han sido utilizados ampliamente para controlar a los culícidos y resultan eficaces en el corto plazo y en situaciones de brote epidémico, pero son poco efectivos en el mediano y largo plazo. Además, poseen baja o nula especificidad, producen desarrollo de resistencia en los insectos, deterioran el ambiente y la salud humana y son tóxicos para organismos no blanco. Por estos motivos, la tendencia mundial en cuanto al manejo de culícidos en el mundo es hacia el Control Bioracional, una estrategia que emplea el control biológico (patógenos, parásitos y depredadores naturales de los mosquitos) así como la utilización de químicos sintéticos que imitan sustancias naturales. Se han citado como causantes de mortalidad en culícidos: virus, protozoos, hongos, nematodos y depredadores, aunque hasta el momento es insuficiente el conocimiento existente sobre la biología, la ecología, sus funciones reguladoras de las poblaciones y las interacciones de los mismos entre sí y con los insectos blanco. Los virus entomopatógenos son un grupo bien representado, con miembros incluidos en siete Familias. Los Baculoviridae (ADN) han sido los más profundamente estudiados y utilizados como agentes de control de insectos perjudiciales debido a las características especiales que poseen: elevada especificidad y resistencia en el2ambiente. Los registros en culícidos se limitan a la especie CuniNPV, hallado en larvas de Culex nigripalpus y Culex quinquefasciatus en Estados Unidos y otro aislamiento en C. quinquefasciatus en Brasil. La familia Iridoviridae (DNA), incluye un gran número de aislamientos tanto de vertebrados como de invertebrados. Los virus iridiscentes de invertebrados han sido estudiados por su posible rol como controlador biológico de especies importantes para la agricultura y la salud pública, aunque fue perdiendo interés debido a las bajas prevalencias y a un rango hospedador muy amplio. Posteriormente se descubrió una importante función reguladora de las poblaciones, dado que produce efectos subletales que afectan negativamente al tiempo de desarrollo y a la fecundidad, entre otros factores.La presencia de un virus iridiscente en mosquitos fue reportada por primera vez en Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus, posteriormente ha sido detectado en variedad de géneros. Para Culex solo hay dos reportes de un virus iridiscente infectando Culex territans de Rusia y Ucrania.El objetivo general de la presente tesis fue contribuir al conocimiento de las patologías producidas por entomovirus en estados inmaduros de culícidos. Para tal fin, se realizó una búsqueda de virus en larvas de mosquitos dentro del área de estudio comprendida en las zonas suburbanas de las ciudades de Berisso, La Plata y Ensenada, Provincia de Buenos Aires, Argentina. Se logró identificar por primera vez en Argentina la presencia de un baculovirus que pertenecería al género Deltabaculovirus en una población del mosquito Aedes (Ochlerotatus) crinifer de Ensenada, Buenos Aires. También se logró identificar un virus de la familia Iridoviridae en una población del mosquito Culex pipiens en Berisso, Buenos Aires, Argentina. Se obtuvo la secuencia del gen de la proteína MCP y según el análisis filogenético de esta secuencia, el MIV de C. pipiens estaría cercano a la especie tipo del género Chloriridovirus. Estos registros constituyen el primero en Argentina de un baculovirus en larvas de mosquitos y el primer reporte mundial de un virus iridiscente en larvas de C. pipiens y de MIV en la región Neotropical. Debido a disponibilidad de material, solo fue posible profundizar sobre las características del iridovirus. El desarrollo de la presente tesis continuó con el estudio de los mecanismos de transmisión horizontal, la patología, la persistencia de las partículas virales en laboratorio y en semicampo y la especificidad de los entomovirus realizando estudios de rango hospedador.3La transmisión horizontal fue casi nula utilizando los mecanismos tradicionales mostrados en estudios anteriores. Solo se obtuvieron altas prevalencias al utilizar el nematodo Strelkovimermis spiculatus como transmisor, debido a la relación directa entre el parasitismo y la infección viral. Observaciones a nivel ultraestructural de las formas pre-parásitas del nematodo expuestas al MIV muestran acarreo de partículas virales sobre la cutícula; de esta manera, el parásito ingresaría el virus a la larva. Aun así, no se descarta una vía de entrada alternativa. Por otro lado, observaciones de campo y laboratorio, nos llevan a especular que los nematodos son susceptibles al virus en alguna etapa de su ciclo vital, pero no fue posible detectar focos de infección viral dentro de los nematodos en ninguna etapa del ciclo evaluada.Para el mantenimiento de la infectividad de la partícula viral a largo plazo, resultó fundamental la presencia de un sustrato; pudiendo resistir, en presencia del mismo, hasta 9 semanas, sumergido, en oscuridad y a 25 ⁰C. Mientras que con luz artificial se observó una caída de la prevalencia desde 64 a 8% en cuatro semanas. En ausencia de sustrato no se observó mantenimiento de la infectividad más allá de una semana.Se concluyó que el virus introducido en un ambiente de cría natural de C. pipiens puede mantenerse infectivo por un tiempo muy prolongado. Esto es debido no solo a la persistencia de las partículas en el sustrato sino también a que la muerte de las larvas infectadas se da de manera asincrónica, posibilitando la perpetuación del inóculo en el ambiente. Además, las partículas virales contenidas en el cadáver permanecen protegidas y retienen la infectividad durante varios días. Mediante estudios de rango hospedador se comprobó la susceptibilidad de Culex apicinus, Aedes (Stegomyia) aegypti y Aedes (Ochlerotatus) albifasciatus a este virus, aunque la prevalencia viral resulto significativamente diferente entre especies, demostrando de esta manera la baja especificidad de este aislamiento.The importance of mosquitoes as diseases vectors of human and domestic animals is increasing. The diseases transmitted by them account for more than 17% of all infectious disease and cause more than 1 million deaths per year around the world. Effective vector control methods are required. More specific knowledge in this area will help us evaluate new perspectives for mosquito control to be used in the framework of integrated management. Chemical insecticides have been widely used for mosquito control and are effective in the short term and in epidemic outbreak situations, but are ineffective in the medium and long term. In addition, they do not have specificity, produce insect resistance and damage to the environment and human health, and are also toxic to non-target organisms. For these reasons the world trend in Culicidae management is towards Biorational Control, a strategy that uses biological control (pathogens, parasites and natural predators of the mosquito) as well as the use of synthetic chemicals that mimic natural substances. Viruses, protozoa, fungi, nematodes and predators have been cited as causes of mortality in Culicidae, although the current knowledge about the biology, the ecology, their role as regulators of natural host populations and their interactions with each other is insufficient. Entomopathogenic viruses are a well-represented group, with members included in seven families. Baculoviridae (DNA) has been the most studied and used viruses as insect control agents because of the special characteristics they: high specificity and resistance in the environment. The only species that has been found in mosquitoes to date is CuniNPV, found in Culex nigripalpus and Culex quinquefasciatus larvae in the United States of America and other isolate in C. quinquefasciatus in Brazil. The family Iridoviridae (DNA) includes a large number of isolates of both vertebrates and invertebrates. Iridescent invertebrate viruses have been studied for their possible role as biological control agents of important insects for agriculture and public health, although it has been losing attention due to low prevalence and a very wide host range. Subsequently, an important function as regulator agents of natural populations was discovered, since it produces sub-lethal effects that negatively affect developmental time and fertility, among other factors. The presence of an iridescent virus in mosquitoes was first reported in Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus, and has subsequently been detected in several genera. For Culex there are only two reports of an iridescent virus infecting Culex territans of Russia and Ukraine. The general objective of this project was to contribute to the knowledge of pathologies produced by entomoviruses in immature stages of mosquitoes. For this purpose, a virus sampling was carried out on mosquito larvae within the study area located in the suburban areas of the cities of Berisso, La Plata and Ensenada in the Province of Buenos Aires, Argentina. It was possible to identify for the first time in Argentina the presence of a baculovirus that would belong to the genus Deltabaculovirus in a population of the mosquito Aedes (Ochlerotatus) crinifer of Ensenada, Buenos Aires. It was also possible to identify a virus of the family Iridoviridae in a population of the mosquito Culex pipiens in Berisso, Buenos Aires, Argentina. The sequence of the Mayor Capsid Protein gene was obtained and according to the phylogenetic analysis, the iridescent virus of C. pipiens is phylogenetically close to the type species of the genus Chloriridovirus. These records constitute the first report in Argentina of a baculovirus in mosquito larvae and the first report of an iridescent virus in C. pipiens larvae around the world and the first mosquito iridescent virus in the Neotropical region. Studies on mechanisms of horizontal transmission, pathology, persistence of the viral particles in the laboratory and semi-natural conditions of Iridovirus were carried out. Finally, the specificity of this isolate of entomovirus was evaluated through studies of mosquito host range. The horizontal transmission was scarce when the traditional mechanisms shown in previous studieswere used. High MIV prevalence in mosquito larvae were only obtained when the nematode Strelkovimermis spiculatus was used as a vector, due to the direct relationship between nematode parasitism and viral infection. Observations at the ultrastructural level of the pre-parasitic nematode exposed to the iridiscent virus showed viral particles on the cuticle, site through which the parasite could introduce the virus into the larva hemocele. Even so, an alternative route of particle entry is not ruled out. On the other hand, field and laboratory observations lead us to believe that nematodes are susceptible to the virus at some stage of their life cycle, but it was not possible to detect virus infection within the nematodes at any evaluated stage of the cycle. The infectivity of viral particles was affected by the presence of a substrate, which allowed them to persist until nine weeks if they were submerged in the dark at 25 ⁰C. On the other hand, the prevalence declined from 64% to 8% in four weeks with artificial light. In the absence of substrate, no maintenance of infectivity was observed beyond one week. It is concluded that the virus introduced into a natural breeding environment of C. pipiens can be kept infective for a very long time. This would be possible, in addition to the effect of the maintenance in the substrate, by theasynchronous death of infected mosquito larvae, allowing the permanence of inoculum in the environment. Furthermore, the viral particles in the corpse remain protected and retain infectivity for several days. By host range studies, the susceptibility of Culex apicinus, Aedes (Stegomyia) aegypti and Aedes (Ochlerotatus) albifasciatus to this virus was verified, although the viral prevalence was significantly different among species, thus demonstrating the low specificity of this isolate.Fil: Muttis, Evangelina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo. Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores; Argentin