Strategies for the development of new varieties of Alfalfa by non-conventional improvement

En la Argentina el sector agropecuario juega un rol fundamental en la economía del país representando un 40% de las exportaciones, con un valor de producción aproximado de aproximadamente 26.700 millones de dólares (1).La superficie agraria estimada total es de aproximadamente unos 31 millones de hectáreas (2) de las cuales se destinan unos 8 millones al desarrollo de cultivos forrajeros perennes. La alfalfa (Medicago sativa) es la principal forrajera del país debido a su gran adaptabilidad a variadas condiciones ambientales, a sus elevados rendimientos en forraje de excelente calidad y a su capacidad para fijar nitrógeno (vía simbiosis con Scinorhizobium mielilotti) (3); se la emplea primordialmente como base nutricional de los sistemas de producción ganadera, tanto de leche como de carne (4). La superficie destinada a su cultivo ronda los 4 millones de hectáreas ya sea en alfalfares puros o consociados con otras especies (5). El rendimiento de la alfalfa alcanza su punto máximo al iniciarse la floración, lo cual depende principalmente de la temperatura y el largo de los días (6). Si bien la biomasa aumenta constantemente durante la primavera y hasta inicios del verano, el rendimiento se ve afectado por dos variables a tener en cuenta, la cantidad de biomasa y la calidad forrajera (digestibilidad, concentración proteica). Las hojas son las estructuras con mayor digestibilidad y elevado contenido proteico (7). Sin embargo, al florecer, la calidad del forraje disminuye debido a cambios en la morfología de la alfalfa, ya que aumenta la proporción de tejidos de sostén (de reducida calidad nutricional) y se redistribuyem los recursos fotosintéticos hacia el desarrollo de las estructuras reproductivas (8) (7). Además, aumenta la lignificación de los tejidos y se engrosan las paredes celulares, lo cual impacta negativamente en la palatabilidad y digestibilidad del cultivo y finalmente redunda en una pérdida considerable de valor nutritivo en la materia prima final. Por lo tanto, retrasar la floración de la alfalfa es un objetivo importante en los programas de mejoramiento. En este trabajo se desarrollaron tres estrategias diferentes para generar variedades de alfalfa con floración retardada por medio de transgénesis. En primer lugar, a partir de la secuenciación parcial del genoma de alfalfa, se identificaron genes con homología a aquellos que tienen roles en la regulación de la floración de leguminosas y de Arabidopsis thaliana. En segundo lugar, se caracterizó funcionalmente a los miembros de las familias FLOWERING LOCUS T (msFTSs) y TERMINAL FLOWERING 1 (msTFL1) como ejemplos, respectivamente, de promotores y represores de la floración. En base a los resultados obtenidos se diseñaron estrategias para manipular los niveles de expresión de dichos genes con el objetivo de manipular la floración en alfalfa. En tercer lugar, se identificó a la familia de los fitocromos de alfalfa compuesta por msphyA, msphyB y msphyE) y se comparó su comportamiento con los homólogos de Arabipopsis thaliana para estimar el grado de conservación funcional. Finalmente, empleando la información obtenida se generaron variedades transgénicas de alfalfa con retraso en la floración y aumento en la relación hoja/tallo, que podrían redundar en un incremento de la calidad forrajera cuando sean cultivadas en el campo. Los resultados indican que los genes caracterizados resultan candidatos eficientes para ser incorporados en programas de desarrollo de variedades transgénicas con floración retrasada o, incluso, posibles dianas de técnicas más modernas, como la edición de genomas, como parte de los mismos programas de mejoramiento.In Argentina the agronomic sector has a central role in the country´s economy, representing 40% of its exports with an approximate production value of 177 thousand billion pesos. The total agricultural surface is around 180 million hectares (1), of which approximately 8 million are destined to forage crop development (2). Alfalfa (Medicago sativa) is Argentina’s primary forage crop, mainly due to its great adaptability to varying external conditions, its excellent high-quality forage yield and its capacity to fix nitrogen (through symbiosis with sinorhizobium mielilotti) (3). Alfalfa is mainly employed as the nutritional base for livestock, for both dairy and meat cattle (4). A total of 3.5 million Ha are cultivated as alfalfa alone or in combination with another species (5). Alfalfa constantly increase in yield during spring and until summer’s onset. The yield is defined by the quality and quantity of the forage itself, where the leaves are the most digestible structures with the higher protein content (7). This yield reaches its peak until flowering, which mainly depends on temperature and day-length. From this point onwards the quality of the forage decreases due to morphological changes, such as an increase in the proportion of steams (of reduced nutritional quality) and a reallocation of photosynthetic resources to the development of reproductive structures (8) (7). Along these, there is an increase in tissue lignification and cell wall thickness; altogether these are changes that diminish the digestibility of the crop. Therefore, this decrease in quality represents a considerable loss of nutritive value. In the following thesis three different strategies to produce alfalfa varieties with delayed flowering through transgenesis were produced. In the first place, a partial sequencing of alfalfa’s genome was performed and we characterized the putative homologues genes of Arabidopsis thaliana genes that have roles in the regulation of flowering. Among them, we focused on the FLOWERING LOCUS T (msFTSs) and TERMINAL FLOWERING 1 (msTFL1) gene families, as examples of promoters and repressors of flowering respectively. Using this information, were developed transgenic alfalfa plants with changes in the expression of the aforementioned genes, in order to delay flowering. In the third place, three red light photoreceptors of alfalfa where identified, namely the phytochromes msphyA, msphyB and msphyE. Their roles in development where compared to the roles of their homologues in Arabidopsis thaliana so as to evaluate their functional conservation. Finally, transgenic varieties of alfalfa overexpressing phytochromes were produced, which presented delayed flowering and an increased leaf/steam ratio. Altogether, these characteristics might have an impact in the quality of the final forage when cultivated. Altogether, the results demonstrate that these families of flowering genes and photoreceptors are good and efficient candidates for their incorporation in future developmental programs and could be as well used in combination with most recent technologies as, for example, genome edition, in order to create new forage crop varieties for an increased field performance.Fil: Lorenzo, Christian Damián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Muschietti, Jorge Prometeo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin