Tissue Engineering - Chondrogenes Differenzierungsverhalten humaner mesenchymaler Stammzellen in einer dreidimensionalen Fibrinmatrix

Tissue Engineering ist ein alternatives Konzept in der biologischen Behandlung von Knorpeldefekten. Ziel dieser Arbeit war es, den kommerziell erhältlichen Fibrinkleber TISSUCOL® (Baxter) als Gerüst für die in vitro Generation von Knorpeltransplantationen in Kombination mit adulten humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) zu testen. Es sollte geklärt werden, ob und in wie weit den hMSCs die Möglichkeit gegeben wird, in dem Fibringerüst einen chondrogenen Charakter zu bilden und so Knorpelmatrix zu synthetisieren. Pluripotente Stammzellen (hMSCs) wurden aus dem adulten humanen Knochenmark isoliert und anschließend mittels FACS (CD105+/CD106+, CD45-/CD14-/CD34-), Differenzierungs-assays sowie anhand des Oct-4 Expressionsprofils charakterisiert. Mittels Zentrifugalkraft ist es gelungen ein neuartiges großporiges 3D Netzwerk mit darin homogen verteilten hMSCs reproduzierbar zu schaffen. Es erlaubt den hMSCs über die gesamte Kulturperiode (21 Tage) sowohl in Proliferationsmedium als auch unter chondrogenen Differenzierungskonditionen unter Normoxie (21% O2) als auch unter Hypoxie (3% O2) vital zu bleiben. Die Morphologie (bestimmt mittels Elektronenmikroskopie) und die Proliferation (Ki67-Färbung) der eingebetteten hMSCs variierten nicht merklich unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen nach 21 Tagen in vitro. Auch der Stammzellmarker Oct-4 wurde während der gesamten Kulturperiode von den Zellen exprimiert. Unter chondrogenen Differenzierungsbedingungen, vornehmlich unter Hypoxie, konnten runde chondrozytenähnliche Zelltypen und ein chondrogener Phänotyp ermittelt via mRNA-Expression von Kollagen II und Alzianblau-färbung beobachtet werden. Es konnte hiermit zum einen gezeigt werden, dass das TISSUCOL® den hMSCs eine Zellvermehrung und eine chondrogene Differenzierung sowohl unter Standardbedingungen, aber vor allem auch unter Hypoxie ermöglicht und somit als Trägermatrix für autologe Knorpeltransplantate in vitro geeignet ist. Andererseits machen die Resultate deutlich, dass die bradytrophe Umwelt von Knorpel in vivo durch hypoxische Kulturbedingungen in vitro nachgeahmt werden kann. Durch diese hypoxischen Kulturbedingungen konnte die Chondrogenese der Zellen positiv beeinflusst werden. Letztendlich fordert die erfolgreiche Generation von knorpelähnlichen Strukturen in vitro unter Verwendung des biologisch abbaubaren Fibrinklebers TISSUCOL® in Kombination mit adulten MSC weitere Experimente, welche u.a. tierexperimentelle Studien hinsichtlich des klinischen Einsatzes beinhalten. Die in dieser Studie erhobenen Daten sind von entscheidender Bedeutung für die Förderung der Effizienz der Therapie mit Stammzellen für den Knorpelersatz. Tissue engineering using biomaterials is a promising solution for cartilage replacement. The purpose of this study was to investigate whether the commercially available fibrin sealant Tissucol® provides a suitable scaffold for the in vitro generation of cartilage transplants using human adult mesenchymal stem cells (hMSCs) and for re-implanting during chondrogenic replacement therapy. Pluripotent stem cells were isolated from adult human bone marrow (hMSCs), cultured and characterised by FACS (CD105+/CD106+, CD45-/CD14-/CD34-), by differentiation-assays for the osteogenic, adipogenic and chondrogenic linage as well as by the Oct4 expression profile. Using an appropriate preparation and applying centrifugal forces leads to a reproducible large-holed porous 3D network in which the hMSCs are homogenously distributed and that allowed hMSCs to survive throughout the period of culture (21 days) in either proliferation or chondrogenic differentiation medium under normoxic (21% O2) or hypoxic (3% O2) conditions. Morphology (as determined by electron microscopy) and proliferation (Ki67 staining) of the embedded hMSCs did not markedly vary under normoxic and hypoxic culture even after 21 days in culture. The stem cell marker Oct-4 was expressed during the whole culture period. Under chondrogenic differentiation conditions, especially under hypoxic conditions, we observed rounded chondrocyte-like cell types and a chondral phenotype as assessed by mRNA expression of collagen II and Alcian blue staining. The present study proved that hMSCs seeded into the large-holed porous preparations of TissucolÒ survived, proliferated and kept their stem cell character. Furthermore, culturing the cells in a corresponding medium induced chondrogenic differentiation, this could be remarkably and significantly enhanced under hypoxic conditions. This firstly qualifies Tissucol® as an adequate scaffold for cartilage generation in vitro and secondly suggests benefits in emulating the bradytrophe environment of cartilage in vivo by studying chondrogenesis in vitro under hypoxic culture conditions. Finally, the successful generation of cartilage-like structures in vitro using the biodegradable, clinically applied fibrin sealant Tissucol® in combination with adult MSCs, accessible from the patient, clearly demands further experiments including animal studies due to the prospect of clinical applications. Our data will be of key relevance for promoting the efficiency of stem cells for chondrogenic replacement therapy