Uso de la Reacción en Cadena de la Polimerasa para caracterizar aislamientos nativos de Bacillus thuringiensis

A methodology based on Polymerase Chain Reaction (PCR) techniques was standardized for the molecular characterization of cry genes in Bacillus thuringiensis. Four oligonucleotides mixes (primers) were used: two General (I and II) -which recognize the genes families cry1, cry2, cry3, cry4 and cry1Ia-, and two Specific (A and B) which recognize the genes family cry1 (cry1Aa, crylAb, cry1Ac, cry1Ba, cry1Ca and cry1Da). The quality of bacterial DNA influenced the amplification product specificity and concentration. The quality of the DNA purified by M. He et al. fast method (Nucleic Ac. Res. 18:1660, 1990) allowed an efficient amplification. The optimum conditions for PCR were achieved using a mixture reaction with a final volume of 20 µL which contained 0.4 µM of each primer, 1X PCR buffer (50 mM KCL, 10mM Tris-HCI, pH 8.3 and 3.0 mM MgCI,), 200 µM dNTP's, 1 U Taq-DNA-polymerase, 10-100 ng of bacterial DNA for the General mixtures and 300-500 ng of bacterial DNA for the Specific mixtures. The amplification program included 30 cycles as follows: denaturation at 94°C, annealing at 53°C and synthesis at 72°C during 20 seconds each one. The standardized methodology could be used routinely in the cry genes amplification of native isolates of B. thuringiensis for the classification, rapid and precise selection according to the potential biological activity as a previous step to toxicity trials against diverse insect pests of agriculture interest.En este estudio se estandarizó una metodología para la caracterización molecular de cepas nativas de Bacillus thuringiensis, la cual se basó en la amplificación de los genes cry mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se utilizaron cuatro mezclas de oligonucleótidos: dos Generales (I y II), los cuales reconocen genes de las familias cry1, cry2, cry3, cry4 y cry1Ia, y dos Específicos (A y B), que identifican los genes de la familia cry1 (cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ba, cry1Ca y cry1Da). La calidad y concentración del ADN bacteriano influyó sobre la especificidad y concentración de los productos obtenidos mediante la amplificación de los genes cry. La calidad del ADN purificado a través del método rápido reportado por M. He et al. (Nucleic Ac. Res. 18:1660, 1990) permitió una amplificación eficiente. Para realizar la PCR en condiciones óptimas, se utilizó una mezcla de reacción con un volumen final de 20 µl, la cual contenía 0,4 µM de cada oligonucleótido, 1X PCR buffer (50 mM KCL, wmM Tris-HCl, pH 8,3 y 3,0 mM MgCl 2), 200 µM de cada dNTP y 1U de Taq-ADN-polimerasa, además de 10-100 y 300- 500 ng de ADN bacterial para las mezclas de los oligonucleótidos Generales y Específicos, respectivamente. El programa de amplificación incluyó 30 ciclos de desnaturalización a 94°C, hibridación a 53°C y síntesis a 72°C durante 20 segundos cada uno. La metodología estandarizada se puede utilizar rutinariamente para amplificar los genes cry procedentes de aislamientos nativos de B. thuringiensis, lo cual permite clasificarlos y seleccionarlos de una manera rápida y precisa de acuerdo con su actividad biológica y potencial biotecnológico; adicionalmente, como paso previo de los ensayos de toxicidad contra diversas especies de insectos plaga de interés agrícola