Ceramida como mediador de la resistencia a insulina producida por el factor de necrosis tumoral alfa en adipocitos marrones

Tumor necrosis factor (TNF) alpha caused insulin resistance on glucose uptake in fetal brown adipocytes. We have explored the hypothesis that some effects of TNFalpha could be mediated by the generation of ceramide, since TNF-alpha treatment induced the production of ceramide in these primary cells. A short-chain ceramide analogue, C2-ceramide, completely precluded insulin-stimulated glucose uptake and insulin- induced GLUT4 translocation to plasma membrane, either determined by Western blot or by immunofluorescent localization of GLUT4. These effects were not produced in the presence of a biologically inactive ceramide analogue, C2-dihydroceramide. Analysis of the phosphatidylinositol (PI) 3-kinase signaling pathway indicated that C2- ceramide was precluding insulin stimulation of Akt kinase activity, but neither PI3- kinase nor PKCzeta activities. C2-ceramide completely abolished insulin-stimulated Akt/PKB phosphorylation on both regulatory residues Thr308 and Ser473 as TNF-alpha did, as well as inhibited insulin-induced mobility shift in Akt1 and Akt2 separated in PAGE. Moreover, C2-ceramide seems to be activating a phosphatase involved in dephosphorylating Akt since 1) a PP2A activity was increased in C2-ceramide and TNF-alpha-treated cells, 2) treatment with okadaic acid concomitantly with C2-ceramide completely restored Akt phosphorylation by insulin and 3) transient transfection of a constitutively active form of Akt did not restore Akt activity. Our results indicate that ceramide produced by TNF-alpha induced insulin resistance in brown adipocytes by maintaining Akt in an inactive dephosphorylated state.La resistencia a la acción de la insulina es la característica fundamental de la Diabetes tipo 2, que afecta al 6% de la población, siendo la Obesidad el factor de riesgo más importante para el desarrollo de la misma. El nexo de unión entre ambas patologías puede ser el factor de necrosis tumoral (TNF) alfa, una citoquina antilipogénica secretada por el propio tejido adiposo. En estudios previos hemos demostrado que el TNF-alfa produce resistencia a la insulina en adipocitos marrones fetales en cultivo primario. TNF-alfa activa varias cascadas de señalización incluyendo la estimulación de esfingomielinasas y la producción de ceramidas tras 30 min de tratamiento. Hemos estudiado el efecto de un análogo de ceramida permeable, de cadena corta (C2-ceramida) añadido exógenamente, sobre los efectos metabólicos de la insulina y su señalización. Este compuesto completamente impide la estimulación del transporte de glucosa por insulina, impidiendo la translocación de GLUT4 a la membrana, tanto determinada por Western blot o por la localización immunofluorescente de GLUT4. El pretratamiento de las células con C2-ceramida previno la fosforilación de Akt total y de las dos isoformas expresadas en los adipocitos marrones, Akt1 y Akt2, pero no inhibió la actividad PI3-quinasa total ni la activación de PKCzeta. La ceramida está activando una fosfatasa implicada en defosforilar Akt, como se desprende de las observaciones siguientes: 1) el tratamiento con ceramida o con TNF-alfa aumenta la actividad fosfatasa PP2A, 2) el tratamiento con ácido okadaico junto con ceramida restaura completamente la fosforilación de Akt por insulina y 3) la transfección transitoria de una forma constitutivamente activa de Akt no restablece la fosforilación de Akt. Estos resultados indican que la ceramida producida por el TNF-alfa induce un estado de resistencia a insulina en los adipocitos marrones, manteniendo Akt en un estado defosforilado e inactivo