Eventos celulares y tisulares determinantes en la formación/reformación de las adherencias

Premio Extraordinario de Doctorado 2011Premio de la Sociedad de Condueños 2010La formación adherencial peritoneal es una de las principales complicaciones que surgen tras una operación quirúrgica en la mayoría de los pacientes y que pueden generar diversos problemas clínicos como son obstrucción intestinal, dolor abdominal crónico, infertilidad y el incremento de los tiempos quirúrgicos en procedimientos posteriores. Una vez establecidas las adherencias, la única medida a la que se puede recurrir es la resección quirúrgica. Sin embargo, algunos cirujanos desaconsejan la realización de la adhesiolisis debido al elevado porcentaje de pacientes en los que se produce la reformación adherencial, pudiendo empeorar los síntomas. Como hipótesis de trabajo, nos planteamos si era posible definir el momento más adecuado para la resección de las adherencias a partir de las características tisulares del tejido que las constituye, previniendo su reformación. Para ello, diseñamos un modelo adhesiogénico experimental en conejo blanco de Nueva Zelanda que consistió en el implante de una malla de polipropileno sobre el peritoneo parietal del animal y que inducía la formación de adherencias a partir del omentum mayoritariamente. Para dar respuesta a nuestra hipótesis, nos propusimos tres objetivos: 1)Análisis del proceso de formación adherencial y determinación del momento de estabilización e irreversibilidad de las adherencias mediante el estudio evolutivo de la citoarquitectura del tejido adherencial (3 (n=6), 7 (n=6) y 14 días (n=6) post-implante) y el papel funcional de los factores de crecimiento TGF-? y el VEGF en dicho proceso. Como tejido control, se emplearon fragmentos de omentum procedente de animales no intervenidos (n=6). 2)Aislamiento y caracterización de la población celular mesenquimal presente en el omentum activado por la presencia de la malla de polipropileno (n=6) y de la población celular que compone las adherencias a los 7 días post-implante procedente de adherencias de composición mayoritariamente adiposa (n=6) y de composición mayoritariamente fibrosa (n=6). Estudio comparativo de ambas poblaciones celulares en cuanto a su capacidad proliferativa, comportamiento en cultivo y fenotipo. 3)Diseño de un modelo de laparoscopia secuencial para la evaluación del proceso de formación de las adherencias en el grupo control (grupo I, n=8) y la eficacia de la resección adherencial en el momento elegido según los resultados obtenidos en el primer objetivo (3 días post-implante) (grupo II, n=8) en la prevención de su reformación. Análisis de las características tisulares del tejido adherencial a largo plazo (90 días post-implante, n=6). Sobre las muestras procedentes de tejido omental y adherencial de cada tiempo de estudio, se realizaron análisis mediante microscopía electrónica de transmisión; estudios histológicos (tinción con hematoxilina-eosina, tricrómico de Masson, rojo Sirio, orceína y PTAH); estudios inmunohistoquímicos para la determinación de TGF-?1, LAP-TGF?1, TGF-?3, VEGF, betaglicano, colágeno I, colágeno III, CD31, desmina, miosina, ?-actina de músculo liso, Nanog, Oct-3/4, macrófagos (RAM-11) y linfocitos T CD4, T CD8 y B; Western Blot (TGF-?1 y LAP-TGF?1) y RT-PCR (TGF-?1, VEGF, colágeno I y colágeno III). Las poblaciones celulares procedentes del primer subcultivo (obtenidas a partir del omentum y del tejido adherencial) fueron sometidas a ensayos de viabilidad celular mediante la técnica de exclusión del azul tripán, proliferación celular mediante citometría de flujo (Cell Trace TM CFSE Cell Proliferation Kit), ensayos de inmunofluorescencia para la determinación de células positivas para diferentes marcadores (Oct-3/4, SSEA-4, podocalixina, CD9, citoqueratina basal, citoqueratina 18, E-caderina, ?-actina de músculo liso, desmina, miosina, vimentina y CD31) y Western Blot (podocalixina, desmina y ?-actina de músculo liso). En nuestro tercer objetivo, se evaluó el porcentaje de la malla cubierta por adherencias a los 3, 7, 14 y 90 días post-implante en ambos grupos de estudio, la capacidad de reformación de las mismas (grupo II) tras la resección adherencial a los 3 días post-implante y la superficie de la malla a los 90 días en ambos grupos de estudio mediante técnicas histológicas y de microscopía electrónica de barrido. Los resultados obtenidos mostraban que la agresión mecánica producida por la presencia de un biomaterial sobre el omentum, y la reacción inmune/inflamatoria de este último generaban una activación de las células mesenquimales subyacentes para generar un tejido de reparación transitorio y sensible a las señales ambientales que podía culminar en la formación estable de una adherencia omental. En las adherencias de 3 días, se iniciaba discretamente el proceso de cicatrización así como la respuesta inflamatoria (macrófagos y linfocitos T CD8). A los 7 días post-implante, se observaba un ambiente claramente inflamatorio (con un incremento significativo de las poblaciones linfocitarias T CD4 y B, así como de los niveles de TGF-?1, TGF-?3, betaglicano, colágeno III y ?-actina de músculo liso) siendo la formación adherencial irreversible a partir de este momento y observándose la diferenciación tisular hacia dos fenotipos diferentes: adherencias de componente adiposo y adherencias de componente fibroso. Estos dos tipos de respuesta reparadora del omentum venían determinados por el balance local de las isoformas TGF-?1 y TGF-?3 que eran dependientes, a su vez, del lugar de ubicación y patrón de distribución de la respuesta inmunitaria/inflamatoria. La predominancia de la isoforma TGF-?1 en el tejido adherencial omental se observó de forma conjunta a la diferenciación de la célula mesenquimal hacia la estirpe miofibroblástica, dando lugar a un proceso cicatrizal. La predominancia de la isoforma TGF-?3 parecía correlacionarse con un proceso regenerativo del tejido adiposo omental. El tejido adherencial de 14 días de madurez mostró la consolidación de ambos fenotipos tisulares y una disminución en la reactividad tisular. Se producía, a este tiempo, una sobreexpresión génica de TGF-?1, VEGF y colágeno I. La consolidación a largo plazo (90 días) del tejido adherencial y la presencia de glomérulos omentales, macrófagos y linfocitos T CD4 en este tejido indicaban el mantenimiento o perpetuación de la respuesta inmune ante la presencia del biomaterial e independiente de la agresión inicial. El análisis detallado y secuencial de los eventos celulares y tisulares del tejido adherencial omental nos permitió establecer que, a los 3 días post-implante, las adherencias estaban formadas por un tejido mesenquimal no comprometido ubicado en un ambiente moderadamente inflamatorio, lo que hacía de este momento el más idóneo para la prevención eficaz de su reformación tras la resección