Samspil BLIMP1 og EZH2 og viðbrögð við glúcocorticoid sterum í U266 mergæxlafrumulínunni

Mergæxli er erfðafræðilega flókin, ólæknandi sjúkdómur þar sem óeðlileg fjölgun er á einstofna illkynja plasmafrumum í beinmerg. B-lymphocyte-induced maturation protein-1 (BLIMP1) og Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) eru umritunarþættir sem tjáðir eru á sama tíma í mergæxlum, en það gerist ekki í eðlilegum plasmafrumum. Markmið þessa verkefnis er að slá út genavirkni þessara umritunarþátta í U266 mergæxlafrumulínunni með CRISPR/Cas9 erfðabreytingartækninni ásamt því að kanna áhrif yfirtjáningar þeirra á næmi við glucocorticoid steranum prednisolone, en glucocorticoid sterar hafa verið mikið notaðir samsett öðrum lyfjum í meðferðum gegn mergæxli. U266 mergæxlafrumur voru rafgataðar og innleiddar með Cas9 og gRNA. Cas9 klippir þá tvíþáttabrot á DNA ef markröðin er eins og gRNA röðin. Cas9 inniheldur puromycin þolgen svo hægt var að auðga fyrir þeim klónum þar sem útsláttur heppnaðist. Erfðamengis-DNA var síðar einangrað úr frumunum og T7 Endonuclease 1 prófun framkvæmd til að sjá hvort Cas9 hafi náð að klippa markröð í erfðamenginu. BLIMP1 og EZH2 voru einnig yfirtjáðir í sömu frumulínu, en til þess þurfti að klóna EZH2 inn í nothæfa genaferju með Gibson Assembly klónunaraðferð. Áhrif yfirtjáningar EZH2 og BLIMP1 var síðan skoðuð ásamt því að skoða hvort yfirtjáning hefði áhrif á svörun við prednisolone með því að lita frumurnar með CFSE og greina í frumuflæðisjá (FACS). Magngreining var svo gerð með qPCR á tjáningu NR3C1 geni sem skráir fyrir glucocorticoid viðtaka. Útsláttur heppnaðist á genavirkni EZH2 sem leiddi til frumudauða. Rannsókn þessi sýndi fram á að yfirtjáning EZH2 og BLIMP1 hafa hamlandi áhrif á frumuskiptingu og þegar frumurnar eru meðhöndlaðar með 1000 μM af prednisolone hemur það frumuskiptingu enn frekar. Eðlileg tjáning var á NR3C1 geni í U266 mergæxlafrumum þar sem EZH2 og BLIMP1 voru yfirtjáð