Transformation of P. tricornutum by electroporation

The objective of this project was to transform the diatom P. tricornutum by electroporation in order to optimize the method. A test protocol was composed in order to incorporate zeocin resistant pPha-T1-GFP plasmid, linearized by ScaI-HF digestion. Transformation of P. tricornutum with electroporation is not entirely new nor is it common either due to poor yield of transformants. Electroporation is a method that offers simple solutions, especially if it’s combined with a successful optimizing protocol. It´s commonly thought that the electroporation itself is a major factor in limited viability but other aspects have not really been pursued as preparation steps regarding the procedure might also be a limiting factor e.g. even the centrifuge speed could compromise the yield. As it turned out the centrifuge speed was limiting viable cells, either by killing them before electrophoresis or leaving them to week to survive the electroporation. After adjustments of the protocol, viable transformants emerged that were verified by their selective markers i.e. showing zeocin resistance and expression of eGFP.Markmið þessa verkefnis var að umbreyta kísilþörungnum P. tricornutum með rafgötun til að bæta heimtur. Tilraunaáætlun var sett saman til þess að koma inn zeocin þolnu pPha-T1- GFP plasmíði, klipptu með ScaI-HF skerðisensími. Umbreyting á P. tricronutum með rafgötun er ekki óþekkt aðferð en hún er almennt ekki talin hagkvæm þar sem hún gefur fremur litlar heimtur af lífvænlegum kísilþörungum. Rafgötun er í sjálfu sér einföld aðferð, sérstaklega ef mögulegt er að hámarka heimtur. Almennt er talið að rafgötunin sjálf leiði til lélegra heimta en fátt er um að leitað hafi verið eftir öðrum þáttum sem gætu haft neikvæð áhrif á heimturnar. Þar má nefna hraða skilvindu sem dæmi um takmarkandi þátt. Í reynd kom í ljós að harkalegur spuni í skilvindu takmarkaði lífvænlegar frumur, annaðhvort með því að drepa þær eða veikja þær of mikið til að þola rafgötunina. Breytingar voru gerðar á verklagi er leiddi til lífvænlegra, umbreyttra kísilþörunga sem síðan fékkst staðfest í gegnum sértæka merkingu m.ö.o. sýndu zeocin-þol og tjáningu á eGFP