Analysis of B and T cell intracellular signaling pathway activation in Selective IgA deficiency

Primary immune deficiencies have been extensively studied and can be useful models for understanding of immune responses. Selective IgA deficiency (SIgAD) is one of the most common primary immune deficiencies. It is characterized by a defect in production of immunoglobulin A (IgA) which is the most produced antibody in humans. SIgAD is defined as serum IgA levels of 0.07 g/l or lower but normal levels of other immunoglobulin types. It has the highest prevalence in Caucasians, affecting 1 in 600. Although most individuals with the deficiency do not show severe symptoms of disease they have a strong susceptibility for mucosal infections, allergic diseases and autoimmunity. It has been shown that B cells from SIgAD individuals can produce IgA in vitro after stimulation mimicking T cell help. Most significantly with interleukin (IL)-21 stimulation and the combined stimulation of IL-10 and IL-4 which seem to not only induce IgA production but normalize it compared with healthy controls. These cytokines exert their effects on cells by intracellular signaling pathways. Therefore, we hypothesized that the fault in SIgAD could lie within the intracellular signaling cascade of these cytokines. The main signaling pathway of these cytokines is the Janus kinase and signal transducer and activator of transcription (Jak-STAT) pathway with overlap with other signaling pathways such as the mitogen activated kinases (MAPKs). These signaling pathways all work by phosphorylation of proteins which then have an effect on gene transcription. The aim of this study was to set up Phosphoflow, a new method for researching intracellular protein phosphorylation using flow cytometry, and to investigate intracellular signaling in B and T cells in response to cytokines important to the production of IgA in healthy individuals as well as SIgAD individuals. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from whole blood and stimulated with the cytokines IL-2, IL-4, IL-10, IL-21, combination of IL-10 and IL-2, combination of IL-10 and IL-4, and CpG oligodeoxynucleotides. Cells were then fixed with formaldehyde, permeabilized with methanol, and then stained with fluorochrome-labeled antibodies against phosphorylated proteins of the Jak-STAT signaling pathways, i.e. pSTAT3, pSTAT5, and pSTAT6, as well as pP38 and pERK1/2 of the MAPK pathways. Phosphoflow setup was achieved and positive signal was detected in all tested signaling pathways along with good distinction in staining between CD20+ B cells and CD3+ T cells. Measurement of signaling responses of three individuals with SIgAD compared with three healthy controls yielded interesting results. A trend was found for decreased fold change of activation of STAT3 in SIgAD individuals as well as increased constitutive phosphorylation of STAT3 in T cells. A trend for synergistic effects of IL-10 and IL-2/IL-4 was observed on STAT5 phosphorylation of both groups. Another trend for lesser percentage of T and B cells positive for phosphorylated STAT5 was seen in the SIgAD group compared with the healthy individuals in response to combined stimulation of IL-10 and IL-4. No statistical differences were seen. Patient cohort needs to be enlarged to confirm these results. Taken together these results might indicate an intrinsic defect in STAT3 signaling pathway of SIgAD individuals. This possibly indicates less response to cytokines that signal through STAT3 such as IL-10. If that is indeed the case it might explain the tendency of SIgAD individuals to develop autoimmunity. A defect in STAT3 signaling could potentially be targeted with intracellular inhibitors which are already in clinical trials and mitigate the adverse effects of the clinical phenotype. First and foremost further research is needed to confirm these observations and other methods employed, e.g. Western blot and transcriptomics.Gallar í ónæmiskerfinu hafa lengi vel verið notaðir sem módel til að draga lærdóm af því hvernig stjórnun á ónæmissvari fer fram. Sértækur IgA skotur (SIgAD) er algengasti ónæmisskorturinn í mönnum. Hann einkennist af galla í framleiðslu á immunoglobulin A (IgA) og er skilgreindur sem minna eða jafnt og 0.07 g/l af IgA í sermi en eðlilegt magn af mótefnum af öðrum gerðum. Sjúkdómurinn er algengastur á vesturlöndum og hrjáir um 1 af hverjum 600. Þótt flestir einstaklingar sýna ekki alvarleg einkenni sjúkdóms eru þeir útsettari fyrir sýkingum og líklegri til þess að þróa með sér ofnæmi og sjálfofnæmi sem skerðir lífsgæði. Sýnt hefur verið fram á að B frumur SIgAD einstaklingar getað myndað IgA in vitro eftir örvanir með boðefnum sem líkja eftir T frumur hjálp. Mesta svörunin fæst með IL-21 og samsettri örvun af IL-10 og IL-4 sem ekki bara ýtir undir IgA framleiðslu heldur kemur henni í eðlilegt horf miðað við heilbrigða einstaklinga. Þessi boðefni miðla áhrifum sínum á frumur með boðum send eftir innanfrumuboðleiðum. Gallinn í frumum SIgAD sem veldur vanframleiðslu gæti því leynst í innanfrumuboðferlum í svari við áður nefndu boðefnanna. Aðal innanfrumuboðferlar þessar boðefna eru Janus kinase and signal transducer and activator of transcription (Jak-STAT) boðleiðin sem einnig skarast við aðrar boðleiðir svo sem mitogen activated kinases (MAPK). Boðleiðirnar virkjast með fosfórun próteina í umfrymi sem síðan hafa áhrif umritun gena í kjarna. Markmið verkefnisins var að setja upp Phosphoflow, sem er ný frumuflæðisjár aðferð til að rannsaka prótein fosfórun, og greina virkjun á innanfrumuboðferlum B og T fruma í svari við boðefnum sem vitað eru mikilvæg fyrir framleiðslu á IgA í heilbrigðum ásamt SIgAD einstaklingum. Einkjarna hvítfrumur voru einangraðar úr heilblóði og örvuð með boðefnunum interleukin (IL)-2, IL-4, IL-10, IL-21, samsettri örvun IL-10 og IL-2, og samsettri örvun IL-10 og IL-4 en einnig Toll like receptor (TLR)-9 bindlinum CpG. Frumurnar voru síðan festar með formaldehýði, frumu og kjarnahimnan götuð með metanóli, síðan merkt með flúorljómandi mótefnum gegn fosfóruðum próteinum Jak-STAT boðleiðinnar, þ.e. pSTAT3, pSTAT5 og pSTAT6, ásamt pP38 og pERk1/2 úr MAPK boðleiðinni. Til að greina í sundur frumuhópa var notast við litun á yfirborðsameindunum CD20 fyrir B frumur og CD3 fyrir T frumur. Uppsetning aðferðarinnar tókst og fékkst jákvæð svörun í öllum boðleiðum sem litað var fyrir ásamt góðri aðgreiningu á B og T frumum. Greining á virkjun innanfrumuboðferla hjá þremur SIgAD einstaklingum borið saman við þrjá heilbrigða einstaklinga gaf áhugaverðar niðurstöður. Tilhneiging um minnkað margfeldi örvunar STAT3 í SIgAD einstaklingum miðað við heilbrigða sást ásamt aukinni grunn fosfórun á STAT3 í T frumum. Tilhneiging um samverkandi áhrif IL-10 og IL-2/4 sáust á fosfórun STAT5, og minnkuð prósenta jákvæðra T og B fruma sást hjá SIgAD hópnum í svari við samsettri örvun IL-10 og IL-4. Ekki tókst að sýna fram á marktækan mun en þörf er á stækkun á þýði. Samantekið gætu þessar niðurstöður bent til innbyggðs galla í STAT3 innanfrumuboðferli SIgAD einstaklinga. Sem gæti þýtt minni svör við boðefnum sem reiða sig á boð í gegnum STAT3 boðleiðina svo sem IL-10. Ef svo reynist vera gæti það útskýrt aukna tilheigingu SIgAD einstaklinga til að þróa með sér sjálfsofnæmi. Galli í STAT3 boðleiðinni væri hugsanlega hægt að meðhöndla með sértækum innanfrumu hindrum sem eru nú þegar í klínískum prófunum og gæti það haft áhrif á sjúkdómsbirtingu SIgAD. Fyrst og fremst þarf frekari tilraunir til þess að til að staðfesta niðurstöður. Auka þarf fjölda mælinga og nýta aðrar aðferðir, svo sem Western blot og mRNA greiningar.Rannís Vísindasjóður Landspítal