Vascular thiol isomerases : targeting and regulation

La protéine disulfure isomérase (PDI) est une protéine de 57 kDa résidant principalement dans le réticulum endoplasmique (ER) où elle est impliquée dans le repliement approprié des protéines nouvellement synthétisées. PDI peut être sécrétée par les plaquettes et les cellules endothéliales pour participer à la formation du thrombus. Cependant, le mécanisme exact par lequel PDI module et régule les substrats est insaisissable. Dans la première partie de cette thèse, une classe des inhibiteurs est identifiée par un criblage à haut débit. Ces inhibiteurs, appelés bepristats, sont avérés inhiber sélectivement le PDI dans la famille des thiols isomérases. L'interférence avec la fixation du substrat permet aux bepristats d'inhiber l'agrégation plaquettaire sans affecter la sécrétion plaquettaire. Les bepristats déplacent le linker X du site de liaison hydrophobe et augmentent l'activité des cysteines catalytiques. Globalement, ces résultats démontrent un mécanisme par lequel la ligature du substrat du site de liaison hydrophobe augmente l'activité catalytique. Dans la deuxième partie de la thèse, la régulation de la PDI dans le système vasculaire a été examinée plus avant. PDI est connu pour interagir avec l'oxyde nitrique par S-nitrosylation. L'activité de la thiol isomérase sur la surface cellulaire des cellules endothéliales peut être inhibée par le NO exogène et la régulation positive endogène de l'eNOS. PDI S-nitrosylé inhibait l'agrégation plaquettaire, la sécrétion et la formation du thrombus. En conclusion, la S-nitrosylation des thiol isomérases représente un mécanisme par lequel le PDI maintient la quiescence dans le système vasculaire.Protein disulfide isomerase (PDI) is a 57 kDa protein mainly residing in the endoplasmic reticulum (ER) where it is involved in the proper folding of newly synthesized proteins. PDI can be secreted by both platelets and endothelial cells to participate in thrombus formation. However, the exact mechanism by which PDI modulates and regulates substrates remains elusive. In the first part of this thesis a class of compounds is identified through high throughput screening. These compounds, termed bepristats, were shown to selectively inhibit PDI within the thiol isomerase family. Interference with substrate binding allows bepristats to inhibit platelet aggregation without affecting platelet secretion. Further biochemical analysis revealed that bepristats displace the x-linker from the hydrophobic binding site and paradoxically increase the activity of catalytic cysteines within the a and a’ domains. Overall, these results demonstrate a mechanism by which substrate ligation of the hydrophobic binding site increases the catalytic activity of thioredoxin-like motif containing domains. In the second part of the thesis the regulation of PDI within the vasculature was further examined. PDI is known to interact with nitric oxide through S-nitrosylation. Nitric oxide is a potent inhibitor of the vasculature. Thiol isomerase activity on the cell surface of endothelial cells can be inhibited by both exogenous NO and endogenous upregulation of eNOS. S-nitrosylated PDI was subsequently shown to inhibit platelet aggregation, secretion and thrombus formation. Concluding, S-nitrosylation of thiol isomerases represents a mechanism by which PDI maintains quiescence within the vasculature