DESIGN, SYNTHESIS BY NITROXIDE MEDIATED POLYMERIZATION AND CHARACTERIZATION ANHYDRIDE CONTAINING COPOLYMER-DRUG CARRIER

In recent years developments in the field of material science and bio-technology, feed off each other and the desired functional structure for use in many areas of design, quality of materials, synthesis, characterization and applications of enables cancer caused deregulation of cell growth and normal genes, or a disease caused by diversion of regulatory mechanisms. In developed countries cancer is the second among the most common cause of death after cardiovascular diseases. According to recent statistics, in 2020, there will more than 15 million cancer patients around the world. Most of cancer depending on the type and stage of cancer localization can be treated with applications such as chemotherapy, surgery, and radiation therapy. Nowadays treatment of cancers is possible not only with cytotoxic drugs and biological agents, but also via antibodies. Cancer therapy drug is analog of a fluorinated pyrimidine. 5- fluorouracil (5-FU) with the wide range of usage and is one way the need as well as a single agent administered to the patient intravenously in combination with anticancer drugs. This drug especially is used to treat ovarian cancer, breast, lung, thyroid cancer, soft tissue sarcomas, and particularly for treat certain types of leukemia. 5-FU have undesirable complications such as irregular heartbeats, heart failure. Other side effects are mouth sores, digestive problems, hair loss, hand and foot syndrome. It is possible to increase the activity of 5-FU and eliminate/or minimize side effects with polymer/5-FU conjugation in biological systems. Polymers, metals, nanoparticles, or maybe ceramic materials could be used as drug delivery systems. Acquire various features changing the shape and size of the particles depending on the material used and the method of production. Liposomes, solid lipid particles, micelles, cells, dendrimers, polymer-drug conjugates, hydrogels are systems studied in this regard. Most anticancer drugs have low molecular weight and can easily penetrate through the cell wall. This reduces the half-life of drugs and causes damage to other cells as well as tumor cells. To reduce side effects, increased bioavailability of the drugs and provide specific targeting, various drug delivery and release systems in different sizes are being developed liposomes, solid lipid nanoparticles, polymeric micelles and self-induced polymeric aggregates comprising these micelles. The aim of thesis is to synthesize of poly(MA-alt-NVP) first in different compositions through charge transfer complex (CTC) copolymerization between N-vinyl pirrolidone (NVP) and maleic anhydrid (MA) by complex radical polymerization and nitroxide mediated polymerization (NMP) with is controlled polymerization technique, further steps involve copolymer characterization and chemical conjugation of 5-Florourasil (5-FU) to this functional and water-soluble special copolymer system. The complex formed between MA and NVP was investigated by using UV-Vis spectroscopy. Complex molar absorption coefficient (εAD), Complex equilibrium constant (KAD) and transition energy (EAD) is determined by using Scott equation. Compositions of the synthesized copolymers were determined by elemental analysis method. Reactivity ratios of MA and NVP monomers in the copolymer were calculated by using elemental analysis data and Kelen-Tüdös (KT), Mayo-Lewis (ML), Fineman-Ross (FR) and Inverted Fineman-Ross (IFR) equations. Obtained poly(MA-alt-NVP) and poly(MA-alt-NVP)-5-FU conjugate via charge transfer complex (CTC) polymerization and nitroxide mediated polymerization (NMP) system and structure properties are clarified by using ATR-FTIR, NMR (1H, 13C ve 19F), XRD, Fluorescence, HR-Raman, UV-Vis, DSC, TGA and determination of molecular weight by using MALDI-TOF-MS methods. Biological activity of poly(MA-alt-NVP) and poly(MA-alt-NVP)-5-FU conjugate were investigated via Saos-2 cells by using the dsDNA method to assess the number of viable cells and cell proliferation.İÇİNDEKİLER ÖZET iii ABSTRACT vi TEŞEKKÜRLER ix TABLOLAR xiv SİMGELER VE KISALTMALARI xxv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1 Serbest Radikal Polimerizasyonu (SRP) 4 2.2. Kontrollü Radikal Polimerizasyonu (KRP) 4 2.2.1. Atom Transfer Radikal Polimerizasyonu (ATRP) 7 2.2.1.1. Monomerler 8 2.2.1.2. Başlatıcılar 8 2.2.1.3. Katalizörler 9 2.2.1.4. Ligandlar 9 2.2.1.5. ATRP’de Kullanılan Çözücü Sistemleri 9 2.2.1.6. ATRP’nin Dezavantajları 9 2.2.2. Tersinir Katılma-Ayrışma Zincir Transfer Polimerizasyonu (RAFT) 10 2.2.2.1. Monomerler 10 2.2.2.2. Başlatıcılar 11 2.2.2.3. RAFT Ajanları 11 2.2.2.4. RAFT’de Kullanılan Çözücü Sistemleri 11 2.2.1.6. RAFT’ın Dezavantajları 11 2.2.3. Nitroksit Aracılığıyla Polimerizasyon (NMP) 12 2.2.3.1. NMP Yönteminde Kullanılan Monomerler 13 2.2.3.2. Başlatıcılar 13 2.2.3.3. NMPʼnin Dezavantajları 13 2.2.4. NMP Polimerizasyonu Tekniği 13 2.2.5 Yük Transfer Kompleks (CTC) Radikal Kopolimerizasyonu 22 2.2.6 Ardışık Kopolimerizasyon 25 2.2.7. Maleik Anhidrit Kopolimerleri 29 2.2.8.1. Poli(maleik anhidrit-ard-N-vinilpirolidon) 29 2.2.8. Kopolimer-İlaç Konjugasyonu 34 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 44 3.1. Kullanılan Maddeler 44 3.2 Sentez Yöntemleri 44 3.2.1. Kompleks Radikal Kopolimerizasyon Yöntemi ile Poli(MA-ard-NVP)ʼin Sentezlenmesi 44 3.2.2. Poli(MA-ard-NVP) Kopolimerin TEMPO varlığında Nitroksit Aracılığıyla Kontrollü Polimerizasyonu (NMP) 45 3.2.3.Kopolimer İlaç Konjugatlarının Sentezi 47 3.3. Analiz Yöntemleri 49 3.3.1. Attenuated Total Reflectance-Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) Spektroskopisi Çalışmaları 49 3.3.2. Nükleer Manyetik Rezonans (NMR (1H, 13C ve 19 F)) Spektroskopisi Çalışmaları 49 3.3.3. HR-Raman Spektroskopisi Çalışmaları 50 3.3.4. X-ışınları kırınımı (XRD) Çalışmaları 50 3.3.5. Elementel Analiz Çalışmaları 50 3.3.6. Ultraviyole-Görünür Bölge (UV-Vis) Spektroskopisi Çalışmaları 50 3.3.7. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) Çalışmaları 51 3.3.8. Termogravimetrik Analizleri (TGA) Çalışmaları 51 3.5.9. Dinamik Mekanik Analiz (DMA) Ölçümleri 51 3.5.10. Matriks ile Desteklenmiş Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş Zamanı Kütle Spektrometresi (MALDI-TOF-MS) Çalışmaları 51 3.5.11. Floresans Spektroskopisi Çalışmaları 52 3.5.12. Kopolimer-İlaç Konjıgatının Biyolojik Aktivitelerinin Belirlenmesi 53 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 55 4.1. Poli(MA-ard-NVP) Kopolimerinin Sentezlenmesi ve Karakterizasyonu 55 4.1.1. Poli(MA-ard-NVP) Kopolimerizasyon Bileşiminin ve Reaktiflik Oranlarının Bulunması 58 4.1.2. Yük Transfer Kompleksi (CTC) Oluşumu 64 4.1.3. Kopolimerlerin ve Kopolimer-İlaç Konjugatının ATR-FTIR Analizi 69 4.1.4. Kopolimerler ve Kopolimer-İlaç Konjugatının1H-NMR Spektroskopisi Çalışmaları 73 4.1.5 Kopolimerler ve Kopolimer-İlaç Konjugatının13C-NMR Spektroskopisi Çalışmaları 77 4.1.6. Kopolimer-İlaç Konjugatının19F-NMR Spektroskopisi Çalışmaları 81 4.1.7. Kopolimerler ve Kopolimer-İlaçKonjugatının HR-Raman Spektroskopisi Çalışmaları 83 4.1.8. Kopolimerler ve Kopolimer-İlaç KonjugatınınX-Işını Kırınımı (XRD) Çalışmaları 86 4.1.9. Kopolimerler ve Kopolimer-İlaç KonjugatınınDiferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) ve Termogravimetrik Analiz (TGA) Çalışmaları 88 4.1.10. Kopolimerler ve Kopolimer-İlaç Konjugatının Dinamik Mekanik Analiz (DMA) Çalışmaları 93 4.1.11. Matriks-Yardımlı Lazer Desorpsiyon/İyonlaştırmalı-Uçuş zamanlı-Kütle Spektrometresi (MALDI-TOF-MS) ile Mol kütlesi Tayini 98 4.1.12. Floresans Spektroskopisi Çalışmaları 100 4.2. NMP Yöntemi ile Sentezlenen Kopolimerler ve Kopolimer-İlaç Konjugatının Yapı-Özelliklerinin İncelenmesi 101 4.2.1. NMP Yöntemi ile Sentezlenen Kopolimerlerin Bileşiminin ve Reaktiflik Oranlarının Bulunması 102 4.2.2. NMP Yöntemi ile Sentezlenen Kopolimerler ve Kopolimer-İlaç Konjugatının ATR-FTIR Analizleri 108 4.2.3. NMP Yöntemi ile Sentezlenen Kopolimerler ve Kopolimer-İlaç Konjugatının 1H-NMR Spektroskopisi Çalışmaları 112 4.2.4. NMP Yöntemi ile Sentezlenen Kopolimerlerin ve Kopolimer-İlaç Konjugatının13C-NMR Spektroskopisi Çalışmaları 117 4.2.5. NMP Yöntemi ile Sentezlenen Kopolimer-İlaç Konjugatının19F-NMR Spektroskopisi Çalışmaları 122 4.2.6. NMP Yöntemi ile Sentezlenen Kopolimerler ve Kopolimer-İlaç Konjugatının X-Işını Difraksiyonu (XRD) Çalışmaları 124 4.2.7. NMP Yöntemi ile Sentezlenen Kopolimerler ve Kopolimer-İlaç Konjugatının HR-Raman Spektroskopisi Çalışmaları 126 4.2.8. NMP Yöntemi ile Sentezlenen Kopolimerler ve Kopolimer-İlaç Konjugatının Termogravimetrik Analiz (TGA) ve Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) Çalışmaları 130 4.2.9. NMP Yöntemi ile Sentezlenen Kopolimerler ve Kopolimer-İlaç Konjugatının Dinamik Mekanik Analiz (DMA) Çalışmaları 136 4.2.10. NMP yöntemi ile sentezlenen poli(MA-ard-NVP) kopolimerin Matriks-Yardımlı Lazer Desorpsiyon/İyonlaştırmalı-Uçuş Zamanlı-Kütle Spektrometresi (MALDI-TOF-MS) ile Mol Kütlesi Tayini 141 4.2.11. Floresans Spektroskopisi Çalışmaları 143 4.3. Polimer ve Polimer-İlaç dsNA Yöntemi ile Biyolojik Aktivitelerinin Belirlenmesi 144 5. TOPLU SONUÇLAR 148 KAYNAKLAR 153 ÖZGEÇMİŞ 173Malzeme biliminde ve biyoteknolojik alandaki son yıllarda olan gelişmeler, birbirini besleyerek birçok alanda kullanılabilecek ve istenilen fonksiyonel yapı ve nitelikte olan malzemelerin tasarımına, sentezine, karakterizasyonuna ve uygulamalarına imkân tanımaktadır. Suda çözünen ilaç taşıma sistemleri büyük moleküllere kovalent olarak bağlanmış kanser kemoterapi ajanları ile elde edilerek var olan yöntemlerdeki istenmeyen etkileri ve biyolojik uyumluluğu sağlamak amacıyla tasarlanarak sentezlenmektedir. Kanser, hücre büyümesini ve gelişmesini sağlayan normal genlerin düzen bozukluğu veya düzenleyici mekanizmalardan sapması ile ortaya çıkan bir hastalıktır. Çoğu kanser türleri lokalizasyonuna ve evrelerine bağlı olarak cerrahi müdahale, radyoterapi ve/veya kemoterapi gibi uygulamalarla tedavi edilebilmektedir. 5-Florourasil (5-FU) en geniş kullanım alanına sahip ve gerek tek bir ajan ile gerekse kombinasyonlu biçimde intravenöz olarak hastaya uygulanan antikanser ilaçlardan biridir. Başta over kanseri olmak üzere, meme, akciğer, tiroid kanseri, yumuşak doku sarkomaları ve bazı tür lösemilerin tedavisinde kullanılır. 5-FU düzensiz kalp atışları, kalp yetmezliği gibi istenmeyen birçok yan etkisi vardır. Biyolojik sistemlerde; polimer-ilaç konjugasyonu kullanılması ile ilacın aktivitesini arttırmak ve istenmeyen yan etkilerinden kurtulmak ya da en aza indirmek mümkün olabilmektedir. Antikanser ilaçlarının büyük kısmı düşük molekül ağırlığına sahiptir ve hücre duvarını geçerek kolayca hücre içine girebilir. Bu durum ilaçların yarı ömrünü azalttığı gibi tümör hücreleri yanında diğer hücrelerin de zarar görmesine sebep olur. İlaç yan etkilerini azaltmak, biyoyararlanımı arttırmak ve spesifik hedeflendirme sağlamak amacıyla lipozomlar, katı lipit nanopartiküller, polimerik miseller ve bu miselleri içeren kendiliğinden oluşan polimerik agregatlar, inorganik ve metal nanopartiküller gibi farklı boyut ve büyüklüklerde çeşitli ilaç taşıma ve salım sistemleri geliştirilmektedir. Bu tezin amacı, N-vinil pirolidon (NVP) ve Maleik anhidrit (MA) monomerlerinin yük transfer kompleksi (CTC) üzerinden kompleks radikal kopolimerizasyonu ve bir kontrollü polimerizasyon yöntemi olan nitroksit aracılığıyla polimerizasyon (NMP) tekniklerinin kullanılması ile farklı kompozisyonlarda poli(MA-ard-NVP) kopolimerlerinin sentezi, kopolimer karakterizasyonu ve her iki yöntemle sentezlenen yapıların özelliklerinin karşılaştırılması ve elde edilen bu fonksiyonel ve suda çözünebilen özel kopolimer sistemlerinin 5-FU ile polimer-ilaç kimyasal konjugasyonudur. MA ve NVP arasında oluşan kompleks UV-Vis spektroskopisi kullanılarak incelenmiştir. Komplekse ait molar absorpsiyon katsayısı (εAD), kompleks denge sabiti (KAD) ve geçiş enerjisi (EAD) Scott eşitliği ile belirlenmiştir. Sentezlenen kopolimerlerin kompozisyonları elementel analiz yöntemi kullanılarak bulunmuştur. Kopolimer içerisinde bulunan MA ve NVP monomerlerinin reaktiflik oranları element analizi verileri ve Kelen-Tüdös (KT), Mayo-Lewis (ML), Fineman-Ross (FR) ve Inverted Fineman-Ross (IFR) denklemleri kullanılarak hesaplanmıştır. Yük transfer kompleks (CTC) üzerinden kompleks radikal kopolimerizasyon ve kontrollü polimerizasyon yöntemi olan nitroksit aracığıyla polimerizasyon (NMP) ile elde edilen kopolimer ve poli(MA-ard-NVP)-5-FU sistemlerinin yapı özellikleri ATR-FTIR, NMR (1H, 13C, 19F), XRD, Floresans, HR-Raman, UV-Vis, DSC, TGA ile belirlenmiştir. MALDI-TOF-MS yöntemi kullanarak molekül ağırlığının tayini yapılmıştır. Antitümor ve biyolojik aktivititeye sahip poli(MA-ard-NVP) ve poli(MA-ard-NVP)- 5FU konjugatları Saos-2 hücreleri üzerinde canlı hücre sayısının ve hücre çoğalmasının değerlendirilmesi amacıyla dsDNA yöntemi kullanarak incelenmiştir