MANYETİK VE MANYETİK OLMAYAN TiO2 BAZLI SABİT FAZLAR İLE GENOMİK DNA İZOLASYONU

The aim of this thesis is the synthesis of monodisperse porous magnetic and non-magnetic titania (titanium dioxide) microspheres with high genomic DNA isolation ability and investigation of genomic DNA isolation performance in batch fashion. At the first stage, monodisperse porous non-magnetic and magnetic titania microspheres were synthesized using the sol-gel method. For synthesis of non-magnetic titania particles, poly (HPMA-Cl-co-EDMA) particles were derivatized by sodium bisulfite and subsequently were utilized as a template in the presence of titanium chloride precursor. Magnetic titania microspheres were synthesized by primarily derivatization using ethylene diamine and subsequently were magnetized by the binary precipitation method using iron salts. The magnetic poly (HPMA-Cl-co-EDMA) microspheres were used as a template and titanium chloride as a precursor. In the second stage, genomic DNA isolation performances of monodisperse porous magnetic and non-magnetic titania microspheres were investigated using calf thymus and human genomic DNA. The effect of type of desorption medium, pH of adsorption medium, initial DNA concentration and amount of sorbent on DNA isolation were performed in batch fashion. By considering the above optimized parameters, the effect of sorbent amount on DNA isolation from whole blood was investigated using non-magnetic titania microspheres. Isolated human genomic DNA was characterized using polymerase chain reaction (PCR) and agarose gel electrophoresis methods. The obtained results showed that monodisperse porous magnetic and non-magnetic titania microspheres exhibited satisfactory genomic DNA isolation performance compared to the conventionally available sorbents and could be offered as an alternative solid phase for solid phase DNA isolation in batch fashion.ÖZET i ABSTRACT iii TEŞEKKÜR v İÇİNDEKİLER vi ÇİZELGELER ix ŞEKİLLER x SİMGELER VE KISALTMALAR xiv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 2 2.1. DNA 2 2.1.1. DNA’nın Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri 4 2.1.2. DNA’nın Spektroskopik ve Termal Özellikleri 4 2.2. İnsan Tam Kanından DNA İzolasyonunda Kullanılan Temel Yöntemler 5 2.2.1. Çözeltiye Dayalı DNA İzolasyon Yöntemleri 7 2.2.1.1. Tuz ile Çöktürme Yöntemi Kullanılarak Yapılan DNA İzolasyonu 7 2.2.1.2. Organik Çözücüler Kullanılarak Yapılan DNA İzolasyonu 7 2.2.2. Katı Fazların Kullanıldığı DNA İzolasyon Yöntemleri 8 2.2.2.1. Silika Partiküller Kullanılarak Yapılan DNA İzolasyonu 8 2.2.2.2. Anyon Değişimi Yöntemi Kullanılarak Yapılan DNA İzolasyonu 9 2.2.2.3. Manyetik Partiküller Kullanılarak Yapılan DNA İzolasyonu 9 2.3. Titanyum Dioksit 10 2.3.1. Titanyum Dioksit Sentezi 10 2.3.1.1. Sol-jel metodu 11 2.3.1.2. Sol-Jel Yöntemi ile TiO2 Sentezi 12 2.3.1.2.1. Alkol Bazlı Sol-Jel Yöntemi ile TiO2 Sentezi 13 2.3.1.2.2. Su Bazlı Sol-Jel Yöntemi ile TiO2 Sentezi 13 2.4. Dispersiyon Polimerizasyonu 13 2.5. Çok Basamaklı Mikrosüspansiyon Polimerizasyonu 16 2.6. Titanyum Dioksit ile DNA İzolasyonu 18 2.7. PCR (Polimeraz zincir reaksiyonu) 19 2.8. Agaroz Jel Elektroforezi 20 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 22 3.1. Kalıp Materyali Olarak Manyetik ve Manyetik Olmayan Monodispers Gözenekli poli(HPMA-Cl-co-EDMA) Sentezi 22 3.1.1. Materyal 22 3.1.2. Dispersiyon Polimerizasyonu ile Çıkış Lateksi Poli(GMA) Sentezi 23 3.1.3. Çok Basamaklı Mikrosüspansiyon Polimerizasyonu ile Monodispers Gözenekli Poli(HPMA-Cl-co-EDMA) Sentezi 24 3.1.4. Poli(HPMA-Cl-co-EDMA) Mikrokürelerinin Sodyum Bisülfit ile Türevlendirilmesi 25 3.1.5. Poli(HPMA-Cl-co-EDMA) Mikrokürelerinin Etilen Diamin ile Türevlendirilmesi 25 3.1.6. Amin Bağlı Poli(HPMA-Cl-co-EDMA) Mikrokürelerin Manyetikleştirilmesi 25 3.2. Sol-Jel Kalıplama Metodu ile Monodispers Gözenekli Manyetik ve Manyetik Olmayan TiO2 Mikrokürelerin Sentezi 26 3.2.1. Materyal 26 3.2.2. Monodispers Gözenekli Manyetik ve Manyetik Olmayan Titanyum Mikrokürelerin Sentezi 26 3.3. Monodispers Gözenekli Manyetik ve Manyetik Olmayan TiO2 Mikrokürelerin Karakterizasyonu 27 3.4. Kesikli Sistemde DNA İzolasyonu 28 3.4.1. Materyal 28 3.4.2. Kesikli Sistemde Buzağı Genomik DNA’sının İzolasyonu 28 3.4.3. Kesikli Sistemde İnsan Genomik DNA’ sının İzolasyonu 30 3.4.4. Kesikli Sistemde Tam Kandan DNA İzolasyonu 31 3.4.4.1. İnsan Tam Kan Örneğinden Lizat Hazırlanması 31 3.4.4.2. İnsan Tam Kan Örneğinden DNA İzolasyonu 31 3.5. İzole Edilen İnsan Genomik DNA’sının Karakterizasyonu 32 3.5.1. Materyal 32 3.5.2. PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) 32 3.5.3. Agaroz Jel Elektroforezi 34 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 35 4.1. Sentezlenen Monodispers Gözenekli Manyetik ve Manyetik Olmayan TiO2 Mikrokürelerin Karakterizasyonu 36 4.2. Monodispers Gözenekli Manyetik ve Manyetik Olmayan TiO2 Mikroküreler ile Kesikli Sistemde Buzağı Genomik DNA’sının İzolasyonu 38 4.2.1. Desorpsiyon Tampon Çözeltisinin Belirlenmesi 38 4.2.2. Adsorpsiyon Tampon pH’ının DNA İzolasyonuna Etkisi 43 4.2.3. DNA Başlangıç Konsantrasyonunun DNA İzolasyonuna Etkisi 44 4.2.4. Sorbent Miktarının DNA İzolasyonuna Etkisi 47 4.3. Monodispers Gözenekli Manyetik ve Manyetik Olmayan TiO2 Mikroküreler ile Kesikli Sistemde İnsan Genomik DNA’sının İzolasyonu 50 4.3.1. DNA Başlangıç Konsantrasyonunun DNA İzolasyonuna Etkisi 50 4.3.2. Sorbent Miktarının DNA İzolasyonuna Etkisi 53 4.4. Monodispers Manyetik Olmayan TiO2 Mikroküreler ile Kesikli Sistemde Tam Kandan DNA İzolasyonu 55 4.4.1. Sorbent Miktarının Tam Kandan DNA İzolasyonuna Etkisi 55 4.5. İzole Edilen İnsan Genomik DNA’sının Karakterizasyonu 57 5. GENEL SONUÇLAR 59 KAYNAKLAR 61Bu tez çalışmasının amacı yüksek genomik DNA izolasyon yeteneğine sahip monodispers gözenekli manyetik ve manyetik olmayan titanyum dioksit mikrokürelerin sentezlenmesi ve sentezlenen mikrokürelerin kesikli sistemdeki genomik DNA izolasyon performanslarının incelenmesidir. İlk aşamada sol-jel metodu kullanılarak monodispers gözenekli manyetik ve manyetik olmayan titanyum dioksit mikroküreler sentezlenmiştir. Manyetik olmayan titanyum dioksit sentezi için poli(HPMA-Cl-co-EDMA) partiküller sodyum bisülfit ile türevlendirilmiş ve ardından titanyum klorür öncülü varlığında kalıp olarak kullanılmıştır. Manyetik titanyum dioksit sentezi için öncelikle etilen diamin ile türevlendirme ve sonrasında demir tuzları ile ikili çöktürme metodu ile manyetikleştirme yapılmıştır. Manyetik poli (HPMA-Cl-co-EDMA) mikroküreler kalıp olarak ve titanyum klorür öncül olarak kullanılmıştır. İkinci aşamada buzağı ve insan genomik DNA’sı kullanılarak monodispers gözenekli manyetik ve manyetik olmayan titanyum dioksit mikrokürelerin genomik DNA izolasyon performansları incelenmiştir. Bu amaçla kesikli sistemde desorpsiyon ortam türü, adsorpsiyon ortam pH’ı, başlangıç DNA konsantrasyonu ve sorbent miktarının DNA izolasyonuna etkisi incelenmiştir. Optimize edilen parametreler dikkate alınarak kesikli sistemde manyetik olmayan titanyum dioksit mikroküreler kullanılarak tam kandan DNA izolasyonunda sorbent miktarının etkisi incelenmiştir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve agaroz jel elektroforezi yöntemleri kullanılarak izole edilen insan genomik DNA’sının karakterizasyonu yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar monodispers gözenekli manyetik ve manyetik olmayan titanyum dioksit mikrokürelerin genel olarak kullanılan sorbentlerle kıyaslandığında tatmin edici bir genomik DNA izolasyon performansına sahip olduğunu ve kesikli sistemde katı fazlı DNA izolasyonu için alternatif bir katı faz olarak sunulabileceğini göstermiştir