POLİ (METİL METAKRİLAT) TABANLI MİKROÇİP KULLANARAK YÜZEYDE GÜÇLENDİRİLMİŞ RAMAN SPEKTROSKOPİSİ ÖLÇÜMÜNE DAYALI LUTEİNİZAN HORMON TAYİNİ

Proteins form many physical and chemical events at the molecular level. The presence of low concentrations of proteins in the environment and complex interactions lead to the development of alternative techniques for the analysis of biomolecules. The World Anti-Doping Agency (WADA) has received a protein class of luteinizing hormone (LH) in the list of prohibited substances for male athletes. Gonadotropin LH, one of the many hormones, is produced by the anterior pituitary gland and is used as doping material since it allows testis to convert cholesterol to testosterone in Leydig cells, thereby increasing blood oxygen carrying capacity. In this study, a sandwich type biosensor based on immunomagnetic separation and Raman labeling for hLH assay was developed. A method has been developed to make homogeneous sandwich formation, washing process and surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) signal measurement in poly (methyl methacrylate) based (PMMA), four chambered microchips connected with capillary valves. For the formation of homogenous sandwich structure, nanoparticles and gold nanoparticles with magnetic properties were synthesized in laboratory and necessary modifications were made. 4-Aminothiophenol (4-ATP) Raman labeling was used to follow the SERS signals. The signal intensity of the C-S group against hLH concentrations of 4-ATP at 1086 cm-1 was plotted on a chart and calibration graph was created. The correlation between hLH concentrations (0-250 IU/L) and SERS signals were linear in the Biorad originated control serum samples (R2 = 0.9942). This study is presented as a new method of analysis after tested in artificial human serum samples for selectivity, sensitivity, and applicability.ÖZET i ABSTRACT iii TEŞEKKÜR v İÇİNDEKİLER vi ŞEKİLLER ix ÇİZELGELER xii SİMGELER ve KISALTMALAR xiii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Glikoproteinler 3 2.1.1. Luteinizan Hormonun Moleküler Yapısı 3 2.1.2. Dolaşım Formu 4 2.1.3. Metabolizasyon 4 2.1.4. Reseptöre Bağlanma ve Aktivasyon 5 2.2. Nanopartiküller 6 2.2.1. Nanopartiküllerin Kullanım Alanları 7 2.2.2. Manyetik Nanopartiküller 8 2.2.3. Manyetik Nanopartiküllerin Sentez Yöntemleri 9 2.2.4. Altın Kaplı Manyetik Nanopartiküller 10 2.2.5. Altın Kaplı Manyetik Nanopartiküller ile Yapılan Bazı Çalışmalar 10 2.2.6. Altın Nanopartiküller 11 2.3. Mikroçip Sistemleri 12 2.4. Raman Spektroskopisi 14 2.4.1. Saçılma Teorisi 15 2.4.2. Raman Spektroskopisi Sistemi 17 2.4.3. Yüzeyi Güçlendirilmiş Raman Spektroskopisi 18 3. MATERYAL VE YÖNTEM 20 3.1. Kimyasal Maddeler 20 3.2. Biyokimyasallar 20 3.3. Çözeltiler 21 3.4. Cihazlar ve Gereçler 22 3.5. Mikroçip Tasarımı ve Üretimi 23 3.6. Yöntem 25 4. DENEYSEL ÇALIŞMALAR VE BULGULAR 29 4.1. Sentez Çalışmaları 29 4.1.1. Manyetik Nanopartiküllerin Sentezi 29 4.1.2. Altın Kaplı Fe3O4 Nanopartiküllerin Sentezi 29 4.2. Küresel Altın Nanopartiküllerin ve Altın Nanoçubukların Sentezi 30 4.3. Karakterizasyon Çalışmaları 31 4.3.1. Altın Kaplı Fe3O4 Nanopartiküllerin Karakterizasyonu 31 4.3.2. Küresel Altın Nanopartiküllerin ve Altın Nanoçubukların Karakterizasyonu 33 4.4. Modifikasyon Çalışmaları 36 4.4.1. Yüzeyde Moleküllerin Tek Tabaka Halinde Düzenlenmesi 36 4.4.2. Raman Etiketinin Bağlanması 36 4.4.3. Karbonil Grupların Aktif Hale Getirilmesi 36 4.4.4. Nanopartikül Yüzeyine Antikorun İmmobilizasyonu 37 4.4.5. Spesifik Olmayan Bağlanmaların Bloklama Ajanları ile Engellenmesi 37 4.4.6. Fe3O4@Au Nanopartiküllerin Protein ile Etkileştirilmesi 37 4.5. Optimizasyon Çalışmaları 37 4.5.1. Raman Mikroskopu Objektifinin Optimizasyonu 37 4.5.2. Deneysel Parametrelerin Optimizasyonu 39 4.5.2.1. Fe3O4@Au NP Miktarının Optimizasyonu 39 4.5.2.2. Altın Nanoçubuk ve Küresel Altın Nanopartikül Miktarının Optimizasyonu 41 4.5.2.3. Altın Nanoçubuklar/Nanoküreler Kullanılarak Elde Edilen SERS Sinyalleri 42 4.5.2.4. NP ile Etkileşen Antikor ve Protein Miktarının Optimizasyonu 43 4.6. Tasarlanan İmmünoanaliz Sistemin Kontrolü 44 4.6.1. Antikor Kullanılmadan Yapılan Nonspesifik Deneme 44 4.6.2. Antikor Seçiciliğinin Test Edilmesi 45 4.7. Kalibrasyon Grafiğinin Oluşturulması 46 4.8. Yöntemin Biorad Orijinli Kontrol Serum Örneklerine Uygulanması 48 4.9. Validasyon Deneyleri 49 5. SONUÇ VE TARTIŞMA 52 6. KAYNAKLAR 57 ÖZGEÇMİŞ 63Proteinler moleküler düzeyde birçok fiziksel ve kimyasal olayı oluşturur. Proteinlerin ortamda düşük derişimlerde bulunmaları ve karmaşık etkileşimler meydana getirmeleri biyomoleküllerin analizi için alternatif tekniklerin geliştirilmesine yol açmaktadır. Dünya Anti-Doping Ajansı (World Anti-Doping Agency), erkek sporcular için yasaklanmış maddeler listesine protein sınıfında yer alan luteinizan hormonunu (LH) almıştır. Çok sayıdaki hormondan biri olan gonadotropin LH, ön hipofiz bezi tarafından üretilir ve testislerin Leydig hücrelerinde kolesterolün testosterona dönüşmesini sağlar, bu sayede kanın oksijen taşıma kapasitesini arttırdığından doping maddesi olarak kullanılır. Bu çalışma kapsamında hLH tayini için immünomanyetik ayırma ve Raman etiketleme esasına dayanan sandviç tipi bir biyosensör geliştirilmiştir. Poli (metil metakrilat) tabanlı (PMMA), birbirine kılcal valf ile bağlanmış dört odacıklı mikroçip içinde homojen sandviç yapısının oluşumuna, yıkama işlemine ve yüzeyde güçlendirilmiş Raman spektroskopisi (YGRS) sinyal ölçümlerine imkan kılan yöntem geliştirilmiştir. Homojen sandviç yapının oluşumu için laboratuvar ortamında manyetik özelliğe sahip nanopartiküller ve altın nanopartiküller sentezlenmiştir ve gerekli modifikasyonlar yapılmıştır. SERS sinyallerinin takibi için 4-Aminotiyofenol (4-ATP) Raman etiketi kullanılmıştır. hLH derişimlerine karşı 4-ATP’nin 1086 cm-1’deki C-S grubuna ait sinyal şiddetlerinin çizelgeye geçirilmesiyle kalibrasyon grafiği oluşturulmuştur. Biorad orijinli kontrol serum örneklerinde hLH derişimleri (0-250 IU/L) ve SERS sinyalleri arasındaki korelasyon doğrusal olarak bulunmuştur (R2=0.9942). Bu çalışma yeni bir analiz yöntemi olarak; seçiciliği, hassasiyeti, yapay insan serumu örneklerinde uygulanabilirliği test edildikten sonra sunulmuştur