KAPİLER ELEKTROKROMATOGRAFİ YÖNTEMİYLE D,L AMPİSİLİN ENANTİYOMERLERİNİN AYRIMI

Ampicillin is effective against gram-positive and gram-negative bacteria and is significantly resistant to acid. Because of these properties, it can be used in the treatment of various infections, making it a pharmacologically important antibiotic. Due to the asymmetric carbon atom in the side chain when synthesized, it is necessary to have two different enantiomeric forms and it needs to be chirally separated because only one form is useful for the body. There are various methods for separating of chiral compounds. Within the scope of the thesis, a micelle electrokinetic capillary chromatography method, as one of sub category of capillary electrophoresis, was used. The enantiomeric separation of ampicillin was carried out by using miscelles which was used as stationary phase in the capillary column. The micelles used in the column was formed by adding an anionic surfactant (SDS) to the electrolyte solution above the critical micelle concentration. Ligand exchange chromatography is one of the methods that separates enantiomeric molecules by using chirality. Ligand exchange is based on the formation of unstable complexes that can act as ligand and the enantiomeric separation is performed through these complexes. In ligand exchange, the enantiomers are separated from each other by means of chiral selectors. In this study, the enantiometric separation of ampicillin was carried out by ligand exchange-micellar electrokinetic chromatography method using L-Lysine monohydrochloride as a ligand and copper (II) sulfate pentahydrate as a central ion. For this aim, firstly L-Lys-Cu2+ amino acid-metal complex was formed to separate the ampicillin compound enantiomerically. UV-VIS spectrophotometer was used to determine the optimal molar ratios of the interacting L-Lys amino acid with the Cu2+ ion forming the L-Lys-Cu2+ complex. Characterization studies of the complex were carried out using FTIR-ATR spectrophotometer. Critical micelle concentration (CMC) was determined by current density measurement. SDS micelles obtained above the critical micelle concentration was interacted with L-Lys-Cu2+ complex. Characterization studies of the micelles and the micelles interacting with the chiral selector were made using high contrast transmission electron microscope, dynamic light scattering spectrophotometer and zetasizer analyzer. Enantiomeric separations were performed using a micellar electrokinetic chromatography method using a capillary electrophoresis instrument. In this chromatography system, the SDS-L-Lys-Cu2+ micelle-chiral selector complex was used as a pseudostationary phase for the enantiomeric separation of ampicillin. When the electrokinetic conditions optimized, the ampicillin was enantiomerically separated. The effect of pH, SDS amount, applied electrical field, pressure, organic solvent ratio and ampicillin enantiomer ratios were investigated on the electrokinetic separation of ampicillin enantiomers. Alfasilin, sold as a drug was purchased from pharmacy and the enantiomeric purity was controlled under optimized electrokinetic conditions to check the usefulness of the prepared pseudostationary phase to control the enantiomeric purity of ampicillin, the penicillin-derived antibiotic in real samples. As a result; the enantiomeric separation of the ampicillin compound was carried out by combining the ligand exchange mechanism with micellar electrokinetic capillary chromatography, the sub category of the capillary electrochromatography, and the optimum conditions for the enantiomeric separation were successfully determined. Key words: Ampicillin, enantiomer, ligand exchange, capillary electrochromatography, micellar electrokinetic capillary chromatography, micelle.ÖZET i ABSTRACT iv TEŞEKKÜR vii İÇİNDEKİLER viii ŞEKİLLER xi ÇİZELGELER xviii SİMGELER VE KISALTMALAR xix 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Antibiyotikler 4 2.1.1. Antibiyotiklerin Sınıflandırılması 4 2.1.1.1. Ampisilin 7 2.1.2. Antibiyotiklerin Kullanım Alanları 9 2.2. İzomeri 10 2.2.1. Enantiyomerler 12 2.2.2. Kiralite 12 2.2.3. Optikçe Aktiflik 12 2.2.4. Rasemik Karışımlar 13 2.2.5. Kiral Ayrımın Gerekliği 13 2.2.6. Kiral Ayırma Yöntemleri 14 2.3. Yüzey Aktif Maddeler 14 2.3.1. Yüzey Aktif Maddelerin Sınıflandırılması 15 2.3.1.1. Doğal Yüzey Aktif Maddeler 15 2.3.1.2. Sentetik Yüzey Aktif Maddeler 15 2.3.2. Kritik Misel Derişimi ve Misel Oluşumu 19 2.3.3. Yüzey Gerilimi ve Ölçüm Yöntemleri 21 2.3.4. Yüzey Aktif Maddelerin Kullanım Alanları 22 2.4. Kapiler Elektroforez 22 2.4.1. Kapiler Elektrokromatografi 26 2.4.1.1. Misel Elektrokinetik Kapiler Kromatografi 28 2.4.1.1.1. Alıkonma Faktörü 30 2.4.1.1.2. Ayırıcılık 31 2.4.2. Ligand Değişim Kapiler Elektroforez (LECE) 31 3. Materyal ve Yöntem 34 3.1. Kromatografik Analiz Sistemleri 35 3.2. Kimyasal Malzemeler ve Materyal 35 3.3. UV-VIS Spektroskopi Yöntemi ile Ligand:Metal iyon (L-Lys:Cu+2) Oranının Belirlenmesi 36 3.4. L-Lys-Cu+2 Amino Asit-Metal Kompleksinin Hazırlanması 36 3.5. Akım Yoğunluğu Yöntemiyle Kritik Misel Derişiminin Belirlenmesi 37 3.6. Farklı Derişimlerde SDS Misel ve SDS-L-Lys-Cu+2 Misel Kompleks Çözeltilerinin Hazırlanması 38 3.7. SDS Misellerinin ve SDS L-Lys-Cu+2 Misel Komplekslerinin Karakterizasyon Çalışmaları 39 3.7.1. Yüksek Kontrastlı Geçirimli Elektron Mikroskobu (CTEM) 39 3.7.2. Zeta Boyut ve Potansiyel Analizleri 40 3.7.3. Dinamik Işık Saçılım Spektroskopisi (DLS) 40 3.8. D,L Ampisilinin Enantiyometrik Ayrımında Kullanılan Kapiler Kolonun Hazırlanması ve Enjeksiyon Koşulları 41 3.9. Enantiyometrik Ayrım için Analiz Koşulları 41 3.9.1. Ayrıma Tampon Çözelti pH’ ının Etkisini İnceleme 41 3.9.2. Ayrıma SDS Derişiminin Etkisini İnceleme 42 3.9.3. Ayrıma Uygulanan Elektrik Alanının Etkisini İnceleme 42 3.9.4. Ayrıma Basıncın Etkisini İnceleme 43 3.9.5. Ayrıma Organik Çözücünün Etkisini İnceleme 43 3.9.6. D-Ampisilin ve L-Ampisilin Oranlarının Ayrıma Etkisini İnceleme 43 3.9.7. Enantiyomer Türünün Tespit Edilmesi 43 3.9.8. Tekrar Kullanılabilirliğin İncelenmesi 44 3.9.9. Gerçek Örnekten Analizler 44 4. BULGULAR 45 4.1. L-Lys-Cu+2 Amino asit-Metal Kompleks Oranının Belirlenmesi ve Optimizasyonunun Yapılması 45 4.2. L-Lys ve L-Lys-Cu+2 Amino asit-Metal Kompleksinin Karakterizasyonu 48 4.2.1. FTIR-ATR Spektrofotometre Analizi 48 4.3. Kritik Misel Derişiminin Belirlenmesi 50 4.4. Farklı Derişimlerde Hazırlanan SDS Misellerinin ve SDS-L-Lys-Cu+2 Misel Komplekslerinin Karakterizasyonu 52 4.4.1. Yüksek Kontrastlı Geçirimli Elektron Mikroskopisi Analizi 53 4.4.2. Zeta Boyut ve Potansiyel Analizleri 55 4.4.3. Dinamik Işık Saçılımı Spektrometrik Analizi 65 4.5. Kinetik Analizler 67 4.5.1. Ayrıma Tampon pH’ ının Etkisi 67 4.5.2. Ayrıma SDS Derişiminin Etkisi 70 4.5.3. Ayrıma Elektrik Alanın Etkisi 73 4.5.4. Ayrıma Basıncın Etkisi 76 4.5.5. Ayrıma Organik Çözücünün Etkisi 79 4.5.6. D-Ampisilin ve L-Ampisilin Oranının Değişiminin İncelenmesi 82 4.5.7. D-Enantiyomeri ile Kinetik Analiz 84 4.5.8. Tekrar Kullanılabilirlik Çalışmaları 86 4.5.9. Gerçek Örnekten (Alfasilin Antibiyotiği) Analizler 87 4.6. Kromatografik Ayrım Gücü Hesaplamaları 89 5. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 92 6. KAYNAKLAR 98 7. ÖZGEÇMİŞ 107Ampisilin, gram-pozitif ve gram-negatif bakterilere karşı etkili ve aside önemli ölçüde dayanıklıdır. Sahip olduğu bu özelliklerden dolayı çeşitli enfeksiyonların tedavisinde kullanılabilmesi, farmakolojik açıdan önemli bir antibiyotik olmasını sağlar. Yan zincirinde bulunan asimetrik karbon atomundan dolayı sentezlendiğinde iki farklı enantiyomerik formunun olması ve vücut için sadece birinin yararlı olmasından dolayı kiral olarak ayrılması gerekmektedir. Kiral bileşiklerin ayrılması için çeşitli yöntemler bulunur. Tez kapsamında bu yöntemlerden kapiler elektroforezin alt dallarından biri olan misel elektrokinetik kapiler kromatografi yöntemi kullanılmıştır. Ampisilinin enantiyomerik ayrımı hazırlanan misellerin kapiler kolon içinde yalancı sabit faz olarak kullanılmasıyla gerçekleştirilmiştir. Kolon içerisinde kullanılan miseller elektrolit çözeltisine kritik misel derişiminin üzerinde anyonik bir yüzey aktif madde (SDS) eklenmesiyle oluşturulmuştur. Ligand değişim kromatografisi enantiyomerik moleküllerin kiraliteye göre ayrılmasını sağlayan yöntemlerden biridir. Ligand değişimi ligand gibi davranabilen kararsız komplekslerin oluşumuna dayanır ve enantiyometrik ayrım bu kompleksler vasıtasıyla gerçekleştirilir. Ligand değişiminde kiral selektörler aracılığıyla enantiyomerler birbirinden ayrılmaktadır. Bu çalışmada L-Lizin monohidroklorür’ ün ligand, bakır (II) sülfat pentahidrat’ ın merkez iyonu olarak kullanılmasıyla ampisilinin enantiyometrik ayrımı ligand değişim-misel elektrokinetik kromatografi yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla ampisilin bileşiğinin enantiyomerik olarak ayrılması için öncelikle L-Lys-Cu+2 aminoasit-metal kompleksi oluşturulmuştur. L-Lys-Cu+2 kompleksini oluşturmak üzere etkileşime giren L-Lys amino asidi ile Cu+2 iyonu arasındaki optimize mol oranlarının belirlenmesi için UV-VIS spektrofotometresinden yararlanılmıştır. Kompleksin karakterizasyon çalışmaları ise FTIR-ATR spektrofotometresi kullanılarak yapılmıştır. Akım yoğunluğu ölçümü ile kritik misel derişimi (CMC) belirlenmiştir. Sonrasında sentezlenen L-Lys-Cu+2 kompleksi ile kritik misel derişimi üzerinde oluşan SDS miseller etkileştirilmiştir. Hazırlanan misellerin ve kiral selektör ile etkileşimde olan misellerin karakterizasyon çalışmaları, yüksek kontrastlı geçirimli elektron mikroskobu, dinamik ışık saçılımı spektrometresi ve zeta boyut ve potansiyel analizörü kullanılarak yapılmıştır. Enantiyomerik ayrımlar kapiler elektroforez cihazı kullanılarak, misel elektrokinetik kapiler kromatografi yöntemiyle yapılmıştır. Bu kromatografi sisteminde, SDS-L-Lys-Cu+2 misel-kiral selektör kompleksi ampisilinin enantiyomerik ayrımı için yalancı sabit faz olarak kullanılmıştır. Elektrokinetik koşullar optimize edildiğinde ampisilinin enantiyomerik olarak ayrımı gerçekleştirilmiştir. Ampisilinin elektrokinetik ayrımına pH’ ın, SDS miktarının, uygulanan elektrik alanının, basıncın, organik çözücü oranının ve ampisilin enantiyomer oranlarının etkisi incelenmiştir. Hazırlanan yalancı sabit fazın gerçek örneklerdeki penisilin türevi antibiyotik olan ampisilinin enantiyomerik saflığının kontrolünde işe yarayabilirliğini kontrol etmek üzere ilaç olarak satılan Alfasilin eczaneden satın alınmış ve optimize edilen elektrokinetik koşullarda enantiyomerik saflık kontrol edilmiştir. Sonuç olarak; ampisilin bileşiğinin enantiyomerleri, kapiler elektrokromatografinin alt dalı olan misel elektrokinetik kapiler kromatografi ile ligand değişim mekanizmasının bir araya getirilmesi ile gerçekleştirilmiş ve enantiyomerik ayrım için optimum koşullar başarılı bir şekilde belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Ampisilin, enantiyomer, ligand değişimi, kapiler elektrokromatografi, misel elektrokinetik kapiler kromatografi, misel