ANTİKOR TAŞIYAN NANOPARTİKÜLLER KULLANARAK HİPERTERMİ İLE TÜMÖR DOKUSUNUN TEDAVİSİ

The number of deaths due to cancer has been increasing so this disease has become one of the most important diseases of mankind. Despite the advances in cancer treatment, there isn't 100 % treatment for this disease and there are many side effects of current treatment methods. For these reasons, researchers are exploring ways to improve existing treatment methods and find new methods. One of the alternative methods used in cancer therapy is hyperthermia treatment. Different energy sources and different nanoparticles are used for hyperthermia technique. In the presented thesis, cancer therapy is investigated with the help of radiofrequency (RF) hyperthermia. Magnetite nanoparticles are used to provide RF hyperthermia. In the other words, the aim of this thesis is to design intelligent inorganic nanoparticles and destroy cancerous cells using RF hyperthermia. For this purpose, firstly magnetite nanoparticles were synthesized by co-precipitation method (10-15 nm). These superparamagnetic nanoparticles were covered with gold ions without losing their magnetic properties. The size of the gold coated magnetite nanoparticles was around 20-30 nm, so the thickness of the gold coating was about 5-10 nm. Magnetic and gold coated magnetic nanoparticles were characterized with Zetapals, FTIR, TEM and VSM. In another step of the thesis work, the surface modification of the gold-coated magnetic nanoparticles was performed. The cysteamine (2-Aminoethanethiol) molecule was used to create a self-assembled monolayers (SAMs). After that monoclonal antibody (MONOCLONAL ANTI-N CAM Clone NCAM-OB11) was immobilized by the EDC / NHS method. The average size of cysteamine functionalized-gold-coated magnetic nanoparticles was between 25 and 35 nm. Then the antenna RF system (144.015 MHz) was contrived for RF hyperthermia. Antibody-nanoparticle binding rate and cytotoxicity test were performed and after that in-vitro and in-vivo experiments were done. In in-vitro studies, a concentration of 20 μg/ml nanoparticle was used according to the results obtained from the antibody-nanoparticle binding rate and the MTT assay. In MCF-7 cells, 58.7 % apoptosis and 14.88 % necrosis were observed in the radiofrequency hyperthermia (144.015 MHz, 120 W, 50 min). Animal experiments were done after the in-vitro step. For this step, tumor were formed in nude mice. Then the antibody immobilized/gold-coated magnetic nanoparticles were injected into the mice in 2 different ways (Intra-tumor and Intra-venous) and MRI image was taken. RF hyperthermia (144.015 MHz, 120 W, 50 min) was applied in continuation of the research. At the end of the third week after this phase, approximately 34% decreased in the tumor sizes of the intravenously treated mice groups and 53% reduced in the tumor sizes of the intravenously cured mice groups.ÖZET i ABSTRACT iii TEŞEKKÜR v İÇİNDEKİLER vi ÇİZELGELER ix ŞEKİLLER x SİMGELER ve KISATMALAR xiv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Kanser ve Tedavi Yöntemleri 3 2.1.1. Cerrahi Yöntemi 3 2.1.2. Radyasyon Tedavisi 4 2.1.3. Kemoterapi 4 2.1.4. Nanoteknoloji ve Kanser Tedavi Yaklaşımı 5 2.1.5. Kanser İstatistikleri 7 2.1.6. Hipertermi ile Kanser Tedavisi 8 2.2. Radyofrekans (RF) Hipertermi 9 2.3. Manyetit Nanopartiküller ve Manyetizma 11 2.3.1. Manyetizma 11 2.3.2. Manyetit Nanopartiküllerin Avantajları ve kullanım Alanları 12 2.3.3. Manyetit Nanopartiküllerin Sentez Yöntemleri 13 2.4. Altın ve Altın Kaplı Manyetit Nanopartiküller 13 2.5. Monoklonal Antikor 15 2.6. Monoklonal Antikorların Uygulamaları 16 2.7. Tez Çalışma Kapsamında Kullanılan Cihazlar 17 2.7.1. Zetapals 17 2.7.2. Fourier Dönüşümlü Infrared Spektroskopisi (FTIR) 17 2.7.3. Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM) 18 2.7.4. Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRI) 18 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 20 3.1. Kimyasallar 20 3.2. Cihazlar 21 3.3. Nanopartikül Sentezi ve Karakterizasyonu 22 3.3.1. Manyetit Nanopartikül Sentezi 22 3.3.2. Altın Kaplı Manyetit Nanopartikül Sentezi 23 3.3.3. Altın Kaplı Manyetit Nanopartiküllerin Yüzey Modifikasyonu (Sisteamin Bağlı Altın Kaplı Manyetit Nanopartikül Sentezi) 24 3.4. Antikor İmmobilizasyonu ve Nanopartiküllerin Sitotoksisite Testi 25 3.4.1. Nanopartiküllerin Üzerine Antikor İmmobilizasyonu 26 3.4.2. Nanopartiküllerin Sitotoksisite Testleri 27 3.5. İn-vitro ve Hayvan Model (İn-vivo) Çalışmaları 28 3.5.1. Hücre Kültürü Çalışmaları (İn-vitro Deneyleri) 28 3.5.2. Hipertermi Tedavisinde Kullanılan RF’ in Kuruluşu 30 3.5.3. Hayvan Model Çalışmaları (İn-vivo Deneyleri) 30 3.5.4. Histopatoloji Değerlendirme 32 4. DENEYSEL BULGULAR 34 4.1. Sentezlenen Nanopartiküllerin Boyut Analizi 34 4.1.1. Manyetit Nanopartiküllerin Boyut Analizi (Zeta-sizer) 34 4.1.2. Altın Kaplı Manyetit Nanopartiküllerin Hidrodinamik Çap Ölçümü 35 4.1.3. Sisteamin Bağlı Altın Kaplı Manyetit Nanopartiküllerin Boyut Analizi 35 4.2. Sentezlenen Nanopartiküllerin Zeta Potansiyel Analizi 36 4.3. Nanopartiküllerin FTIR (Fourier Dönüşümlü İnfrared Spektroskopi) Analizi 38 4.3.1. Manyetit Nanopartiküllerin FTIR Analizi 38 4.3.2. Altın Kaplı Manyetit Nanopartiküllerin FTIR Analizi 39 4.3.3. Sisteamin Bağlı Altın Kaplı Manyetit Nanopartiküllerin FTIR Analizi 40 4.3.4. Antikor İmmobilizasyonulu Nanopartiküllerin FTIR Analizi 40 4.4. Titreşimli Manyetometre ile Nanopartiküllerin Doygunluk Mıknatıslığı Analizi 41 4.5. TEM (Transmisyon Elektron Mikroskop) Analizi 42 4.5.1. Manyetit Nanopartiküllerin TEM Analizi 42 4.5.2. Altın Kaplı Manyetit Nanopartiküllerin TEM Analizi 43 4.6. Ninhydrin Test Analizi 44 4.7. Monoklonal Antikor-Nanopartikül Bağlanma Oranı 44 4.8. Sitotoksisite Testi 45 4.9. İn-vitro Çalışmalarından Elde Edilen Sonuçlar 46 4.10. İn-vivo Çalışmalarından Elde Edilen Sonuçlar 51 4.10.1. Nanopartikül Enjekte Edilen Farelere Radyo Frekans Uygulama 55 4.10.2. Tümörlerin Tedavi sonrası Histopatoloji Değerlendirmesi 61 5. SONUÇLAR 64 6. KAYNAKLAR 68 ÖZGEÇMİŞ 78Son zamanlarda kanser hastalığı nedeniyle ölüm sayısının artmasından dolayı, bu hastalık insanlığın en önemli hastalıklarından birisi haline gelmiştir. Kanser tedavisindeki ilerlemelere rağmen bu hastalıkta % 100 tedavi sağlanmamaktadır ve mevcut tedavi yöntemlerinin birçok yan etkilerinin olduğu tespit edilmektedir. Açıklanan nedenlerden dolayı araştırmacılar var olan tedavi yöntemlerini geliştirmek ve yeni yöntemler bulmak için arama çalışmaları yapmaktadır. Son dönemlerde kullanılan alternatif yöntemlerden biri hipertermi tedavisidir. Hipertermi tekniği için farklı enerji kaynakları ve farklı nanopartiküller kullanılmaktadır. Sunulan tez kapsamında radyo frekans hipertermi yardımıyla kanser (tümör dokusu) tedavisi araştırılmıştır. RF hiperterminin sağlanması için manyetik özellikli nanopartiküller kullanılmaktadır. Bu çalışmanın amacı, kanserli hücreleri yok etmek için akıllı inorganik nanopartiküller tasarlayıp, RF kullanarak hipertermi üretmektir. Bu amaçla ilk olarak manyetit nanopartiküller ikili çökeltme yöntemi ile 10-15 nm boyutunda sentezlenmiştir. Bu süperparamanyetit nanoparçacıklar, daha sonra manyetik özelliklerini kaybetmeden altın iyonları ile kaplanmıştır. Altın kaplı manyetit nanopartiküllerin boyutu 20-30 nm civarında oldu, dolaysıyla altın kaplamanın kalınlığı yaklaşık 5-10 nm olarak tespit edilmiştir. Sentezlenen manyetit ve altın kaplı manyetit nanopartiküller zeta-sizer, zeta potansiyel, FTIR, TEM ve VSM kullanılarak karakterize edilmiştir. Tez çalışmasının diğer aşamasında kanserli hücrelerin reseptörüne (MCF-7 meme kanseri hücreleri) spesifik olarak bağlanan antikoru (MONOCLONAL ANTI-N CAM Clone NCAM-OB11) sentezlenen nanopartiküllere immobilize etmek için altın kaplı manyetit nanopartiküllerin yüzey modifikasyonu yapılmıştır. Sisteamin molekülü (bir ucunda –SH ve diğer ucunda –NH2 grubu) kendiliğinden yerleşen tek tabaka (SAMs) oluşturmak için kullanılmıştır. Sisteamin bağlı altın kaplı manyetit nanopartiküllerin ortalama boyutları 25-35 nm arasında olarak elde edilip, monoklonal antikor EDC/NHS yöntemi ile immobilize edilmiştir. Daha sonra anten modüllü RF jeneratörü (144.015 MHz) RF hipertermi aşamaları için kombine edilmiştir. Antikor-nanopartikül bağlanma oranı ve sitotoksisite testi yapılıp, in-vitro ve in-vivo deneyleri yapılmıştır. İn-vitro çalışmalarında, antikor-nanopartikül bağlanma oranı ve MTT testinden elde edilen sonuçlara göre 20 µg/ml nanopartikül konsantrasyonu kullanılmıştır. Radyo frekans hipertermi (144.015 MHz, 120 W, 50 dk.) sonucu MCF-7 hücrelerinde % 58.7 apoptoz ve % 14.88 nekroz gözlenmiştir. İn-vitro aşamasından sonra hayvan deneyleri yapılmıştır. Bunun için ilk olarak nude farelerde tümör oluşturulmuştur. Daha sonra sentezlenen antikor bağlı altın kaplı manyetit nanopartiküller 2 farklı yolla (intra tümör ve intra venöz) farelere enjekte edilip MRI görüntüsü alınmıştır. Çalışmanın devamında RF hipertermisi (144.015 MHz, 120 W, 50 dk.) uygulanmıştır. Bu aşamadan sonra üçüncü haftanın sonunda intra venöz şeklinde tedavi edilen farelerin tümör boyutlarında yaklaşık %34 ve intra venöz gurubundaki farelerin tümör boyutlarında ise yaklaşık % 53 küçülme kaydedilmiştir