Bazı Farmakolojik Şaperonların Mutant AVPR2 Proteinlerinde Gözlemlenen Fonksiyon Kayıpları Üzerine Etkilerinin Araştırılması

Faults in protein folding cause production of abnormal or immature proteins. Misfolded proteins accumulate in aggregates and have toxic effect in endoplasmic reticulum. This process results in conformational diseases caused by mutations in related genes which disrupt protein homeostasis. Various research groups proved that small cell-permeable molecules, called pharmacological chaperones, have therapeutic effects on conformational diseases. These small compounds stabilize misfolded proteins, allowing them to fold in their natural form, thus create a structure which helps them regain their three-dimensional molecular forms and their functions. Mutations in AVPR2 and related genes cause NDI which is the X-linked; a conformational disease. Mutations in AVPR2 gene - that cause NDI - can cause formation of receptors in different phenotypes. However, in vitro AVPR2 expression studies show that these intracellular receptors, which are misfolded as a result of the mutation and caught in quality control system of endoplasmic reticulum, can fulfill their functions when they reach the apical membrane. Purpose of this study is to investigate R68W, R67_G69/G107W (Compound heterozygote) and T273M mutant AVPR2 proteins which causes NDI disease and loss of functions, through pharmacological chaperone application; and observe if they are released from quality control mechanism and reach the apical membrane where they fulfill their functions. In experimental studies conducted for this purpose, plasmids used in previous studies, containing wild-type and mutant AVPR2 gene sequences, were transferred into COS-7 cells by transient transfection method. Three different pharmacological chaperones, non-peptide antagonists OPC41061 (Tolvaptan), OPC31260 (Mozavaptan) and OPC21268 were applied to transfected mutant and wild-type COS-7 cells. Cell surface ELISA and total ELISA methods were applied to determine intracellular and cell surface expression of mutant and wild-type AVPR2. Pharmacological chaperone effect was observed by comparing the results of function loss performed in previous studies to ELISA results after pharmacological chaperone application. Additionally, in order to determine the location of mutant and wild-type AVPR2s in the cells after pharmacological chaperone application, imaging studies in florescence microscope were performed after ER-tracker and Golgi apparatus-tracer dyeing method. All experimental studies proved, pharmacological chaperones of OPC41061, OPC31260 and OPC21268 were successful on R68W, R67_G69/G107W (Compound heterozygote) and T273M mutant AVPR2 proteins. Observations showed that ratio of mutant proteins reaching cell surface and their intracellular quantities are higher compared to control group mutant proteins. Keywords: Pharmacological Chaperones, Quality Control Systems, Nephrogenic Diabetes Insipidus, AVPR2 MutationsETİK i ÖZET i ABSTRACT iv TEŞEKKÜR vii İÇİNDEKİLER viii ÇİZELGELER xi ŞEKİLLER xii SİMGELER VE KISALTMALAR xiii 1.GİRİŞ 1 2.GENEL BİLGİ 2 2.1. Farmakolojik Şaperonlar 2 2.2. Farmakolojik Şaperonların Etki Konsantrasyonları 5 2.3. Farmakolojik Şaperonların Yapısal Mekanizması 5 2.3.1. Rekabetçi Antagonistler/İnhibitörler 6 2.3.2. Agonistler, Ters Agonistler, Kısmi Agonistler ve Allosterik Ligandlar 8 2.4. Farmakolojik Şaperonların Hedef Proteinler Üzerindeki Etkisi 15 2.4.1. Moleküler Yapıların Farmakolojik Şaperonlar ile Stabilizasyonu 15 2.5. Farmakolojik Şaperonlar ve Proteostaz Düzenleyicilerin Hedef Proteinler Üzerindeki İşbirliği 18 2.6. Endoplazmik Retikulum Kalite Kontrol Sistemi 21 2.6.1. Birincil Kalite Kontrol; ER-İlişkili Katlanma 22 2.6.2. İkincil Kalite Kontrol; Taşıma Yolağı 24 2.6.3. Üçüncül Kalite Kontrol; Hedef Bölgeye Ulaşma 25 2.7. NDI Hastalığına Neden Olan ve Endoplazmik Retikulum Kalite Kontrol Sistemine Takılı Kalan AVPR2 Mutantları 26 2.7.1. Transmembran Domeyn Mutasyonları 26 2.7.2. Sistein Mutasyonları 27 2.6.2.3. Hücre İçi Halka ve C-Ucu Mutasyonları 28 3.MATERYAL VE YÖNTEM 32 3.1. Mutant ve Yabanıl Tip AVPR2 Dizilerini İçeren Memeli İfade Vektörlerinin E.coli (DH5) Hücrelerine Transforme Edilmesi 33 3.2. Mutant ve Yabanıl Tip AVPR2 Dizilerini İçeren Memeli İfade Vektörlerinin Çoğaltılması 34 3.3. COS-7 Hücrelerinin Üretilmesi ve Hazırlanması 35 3.4. Yabanıl ve Mutant DNA Dizilerini İçeren Memeli İfade Vektörlerinin COS-7 Hücresine Transfeksiyonu 37 3.5. AVPR2 Mutantlarına, Farmakolojik Şaperon Uygulaması için Konsantrasyon Belirlenmesi; MTT Testi 38 3.6. Farmakolojik Şaperon Uygulaması Yapılmış Yabanıl Tip ve Mutant AVPR2’lerin Hücre İçi ve Hücre Yüzeyindeki İfadelerinin Belirlenmesi 40 3.6.1. Hücre Yüzey ELISA Yöntemi İçin COS-7 Hücrelerinin Çoğaltılması ve Transfeksiyonu 41 3.6.2. Hücre Yüzey ELISA Yöntemi İçin Farmakolojik Şaperon Uygulaması 41 3.6.3. Yüzey ELISA Yöntemi 42 3.6.4. Total ELISA Yöntemi İçin COS-7 Hücrelerinin Çoğaltılması ve Transfeksiyonu 43 3.6.5. Total ELISA Yöntemi İçin Farmakolojik Şaperon Uygulaması 44 3.6.6. Total ELISA Yöntemi 44 3.7. Floresan Görüntüleme Çalışmaları 46 3.7.1. Floresan Görüntüleme Çalışmaları İçin COS-7 Hücrelerinin Çoğaltılması ve Transfeksiyonu 46 3.7.2. Floresan Görüntüleme İçin Farmakolojik Şaperon Uygulaması 47 3.7.3. Floresan Görüntüleme Yöntemi 47 3.7.3.1. Hücrelerin ER-İzleyici ile Boyanması 47 3.7.3.2. COS-7 Hücrelerinin Golgi Aygıtı-İzleyici ile Boyama 48 3.8. Farmakolojik Şaperonların Etkilerinin Tespiti İçin Yapılan Tekrarlı Ölçümler Varyans Analizi (Tekrarlı Ölçümler ANOVA) 49 3.9. İstatistiksel Testler 49 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 50 4.1. R68W Mutasyonu Sonuçları 71 4.2. ΔR67_G69/G107W, ΔR67_G69 ve G107W Mutasyonu Sonuçları 73 4.3. T273M Mutasyonu Sonuçları 75 5. KAYNAKLAR 78 ÖZGEÇMİŞ 93Protein katlanmasındaki hatalar, anormal ya da olgunlaşmamış proteinlerin meydana gelmesine neden olmaktadır. Yanlış katlanmış proteinler agregatlar halinde birikmekte ve endoplazmik retikulumda toksik etki yaratmaktadırlar. Bu süreç, ilgili genlerdeki mutasyonların neden olduğu ve protein homeostatisini bozan konformasyonel hastalıklara neden olmaktadır. Çeşitli araştırma grupları, farmakolojik şaperon olarak adlandırılan küçük hücre-geçirgen moleküllerin, konformasyonel hastalıklar üzerinde terapatik etkiye sahip olduklarını göstermişlerdir. Bu küçük bileşikler, yanlış katlanmış proteinleri stabilize ederek doğal bir şekilde kendilerine özgü katlanmalarına izin vermektedir. Dolayısıyla işlevlerini geri kazanabilecekleri moleküler üç boyutlu formlarını kazanmalarına yardımcı bir iskelet oluşturmaktadırlar. Arjinin Vazopressin Reseptör 2 (AVPR2) ve onu kodlayan genlerde oluşan mutasyonlar; nadir bir hastalık olan X’e bağlı Nefrojenik Diabetes İnsipidus’a (NDI) neden olmaktadır. NDI’a neden olan AVPR2 genindeki mutasyonlar farklı fenotipte reseptör oluşumuna neden olabilirler. Ancak in vitro AVPR2 çalışmalarında, oluşan mutasyon sonucu yanlış katlanan ve endoplazmik retikulum kalite kontrol sistemine takılı kalan bu hücre içi reseptörlerin, apikal membrana ulaştıklarında fonksiyonel işlevlerini yerine getirebildikleri gösterilmiştir. Bu çalışmanın amacı; NDI hastalığına neden olan ve fonksiyon kaybına neden olduğu tespit edilen R68W, R67_G69/G107W (Compound hemizigot) ve T273M mutant AVPR2 proteinlerinin farmakolojik şaperon uygulamasıyla, kalite kontrol sisteminden kurtarılıp görev gördükleri apikal membrana ulaşma durumlarının araştırılmasıdır. Bu amaçla yapılan deneysel çalışmalarda, yabanıl tip ve mutant AVPR2 gen dizilerini içeren plazmidler COS-7 hücrelerine geçici transfeksiyon yöntemi ile aktarılmıştır. Transfekte mutant ve yabanıl tip COS-7 hücrelerine üç farklı farmakolojik şaperon, peptid olmayan antagonist OPC41061 (Tolvaptan), OPC31260 (Mozavaptan) ve OPC21268 uygulaması yapılmıştır. Mutant ve yabanıl tip AVPR2’lerin hücre içi ve hücre yüzeyi miktarlarının belirlenmesi için, hücre yüzey ELISA ve total ELISA yöntemi uygulanmıştır. Önceki çalışmalar kapsamında gerçekleştirilen mutant proteinlerin normal şartlar altında elde edilen sonuçları ile farmakolojik şaperon uygulama sonrasındaki ELISA sonuçları karşılaştırılarak, farmakolojik şaperon etkisi gözlemlenmiştir. Ayrıca farmakolojik şaperon uygulama sonrası mutant ve yabanıl tip AVPR2’lerin hücre içerisindeki yerleşimlerini tespit etmek amacıyla Endoplazmik Retikulum (ER)-izleyici ve Golgi aygıtı-izleyici boyama yöntemi sonrası floresans mikroskobunda görüntüleme çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Yapılan tüm deneysel çalışmalar sonucu, OPC41061, OPC31260 ve OPC21268 farmakolojik şaperonlarının, R68W, R67_G69/G107W (Compound hemizigot) ve T273M mutant AVPR2 proteinlerin üzerinde başarılı olduğu tespit edilmiştir. Mutant proteinlerin, kontrol grubu mutant proteinlerine oranla hücre yüzeyine ulaşmalarında ve toplam hücre içi miktarlarında artış gözlemlenmiştir. Anahtar kelimeler: Farmakolojik Şaperonlar, Kalite Kontrol Sistemleri, Nefrojenik Diabetes Insipidus, AVPR2 mutasyonlar