Hidrojen Peroksite Maruz Kalan Fare Miyoblast Hücre Hattında Oluşan Atrofiye, Melatonin Uygulanmasının Kalpain-1 İfadelenmesine ve Atrofik Morfolojiye Etkisinin İncelenmesi

KARIMISAKHVIDI, N., Investigation of the effect of melatonin administration on calpain-1 expression and atrophic morphology on atrophy of mouse Myoblast cell line exposed to hydrogen peroxide, Hacettepe Graduate School of Health Sciences, Ph.D. Thesis in Physiology, Ankara, 2018. It is known that oxidative stress is the main factor in the formation of disuse muscle atrophy which is the most common type of muscle atrophy. Various treatment options are available to eliminate this effect. The first important damage which is done by oxidative stress on contractile protein integrity induced by proteases such as calpain-1 has been demonstrated in several studies. Antioxidant treatment is an effective treatment option to prevent atrophy due to oxidative stress. In the antioxidant, a more effective treatment option of the “mitochondrial targeted antioxidants” group such as Melatonin is prominent. In our study, the effects of melatonin application on the expression of the calpain-1 protease and the effects of melatonin on the redox balance and morphology were first investigated in the literature. We have used H2O2 to generate oxidative stress in our study. Four groups of C2C12 cells were created under the same conditions and in the same passage number. K (Control), M (Melatonin), H (H2O2), M + H (Melatonin+H2O2) groups were formed as described in the experimental protocol and the diameters of the myotubes were measured for morphological evaluation. Morphological evaluation revealed a significant difference between the groups (p<0.05). After morphological evaluation, Calpain-1 protein amounts were measured in total protein lysates. Calpain 1 protein amount was less in group K compared to other groups. TAS and TOS kits were used to find out the antioxidant/oxidant statuses of the cells. H group showed higher increase when we compared with other groups in TOS amounts. The highest mean TAS value that could be explained by the rebound effect was observed in the H group. These results suggest that H2O2 produces muscle atrophy in C2C12 cells and that melatonin morphologically prevents atrophy. Melatonin may be involved other mechanisms which cause disuse muscle atrophy other than calpain-1 protein effect. Functional studies need to be carried out to better explain this effect.Çalışmamız Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi (Hızlı Destek Projesi -16063) tarafından desteklenmiştir.ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xii ŞEKİLLER xv TABLOLAR xviii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. İskelet Kası ve İşlevleri 3 2.2. İskelet Kasının Farklılaşması 4 2.3. İskelet Kasının Plastisitesi 5 2.3.1. İskelet Kas Kitlesinin Korunma Yolakları 5 2.4. Kas Atrofisi 6 2.4.1. Kas Atrofisini Düzenleyen Sinyal Yolakları 7 2.4.2. Kas Atrofisinde Aktive Olan Proteolitik Yolaklar 9 2.5. Kalpainler ve Kaspazlar 12 2.5.1.Kaspazlar 12 2.5.2. Kalpainler 12 2.6. Kullanılmamaya Bağlı Kas Atrofisi 15 2.6.1.ROS ve Oksidatif Stres 15 2.6.2. Mitokondri 16 2.7. Antioksidanlar 17 2.7.1. Mitokondriyi Hedefleyen Antioksidanlar (MTA) 17 2.7.2. Melatonin 18 2.8. Melatonin ve Kalpain Etkileşimi 21 2.9. Melatonin ve Proteazom İnhibitörü Etkileri Arasındaki Benzerlik 22 2.9.1. Melatonin Etkileri İçin Ubikitin-Proteazom Hipotezi 23 2.10. Melatoninin Prooksidan Etkisi 23 2.11. İskelet Kası Çalışmalarında Kullanılan Deneysel Modeller 24 2.11.1. In vivo Modeller 24 2.11.2. In vitro Modeller 24 2.12. Amaç ve Hipotez 25 2.12.1. Amaç 25 2.12.2. Hipotez 25 3. GEREÇ ve YÖNTEM 26 3.1. Gereçler 26 3.1.1. Hücre Kültürü 26 3.1.2. Hücre Canlılık Testi 26 3.1.3. MTT Yöntemi 27 3.1.4. Hücrelere Kimyasalların Uygulaması 27 3.1.5. Miyotüp Çap Ölçümü 27 3.1.6. Protein İzolasyonu 27 3.1.7. Protein Miktar Tayini 28 3.1.8. Western Blot 28 3.1.9. TAS ve TOS Ölçümleri 29 3.2. Yöntemler 29 3.2.1. C2C12 Hücrelerinin Çoğaltılması 29 3.2.2. C2C12 Hücrelerine Melatonin ve H2O2 Uygulanmadan Önce MTT Yöntemi Aracılıyla IC50 Değerlerinin Belirlenmesi 33 3.2.3. Deney Gruplarının Oluşturulması ve Uygulama Planı 34 3.2.4. Image J Programıyla Miyotüp Çapı Ölçümü 35 3.2.5. C2C12 Hücrelerinden Protein İzolasyonu 37 3.2.6. Bradford Yöntemi Kullanılarak TPL Protein Konsantrasyonlarının Belirtilmesi 37 3.2.7. Western Blot 37 3.2.8. TAS ve TOS Kitleri ile Yapılan Oksidan ve Antioksidan Seviye Ölçümleri 40 3.2.9. İstatiksel Analiz 42 4. BULGULAR 43 4.1. MTT yöntemiyle IC50 Değerlerinin belirlenmesi 43 4.2. C2C12 Hücrelerinin Farklı Büyüme ve Farklılaşma Dönemlerindeki Morfolojik Özelliklerinin Deney Grupları Arasında Karşılaştırılması 45 4.3. Image J Programıyla Deney Gruplarının Morfolojik Değerlendirilmesi 50 4.4. Deney Grupları Morfolojik Ölçüm Değerlerinin Karşılaştırılması 52 4.5. Deney Gruplarından Elde Edilen Total Protein Lizatlarınındaki Protein Konsantrasyonların Belirlenmesi 55 4.6. Kalpain 1 Protein İfadelenmesinin Değerlendirilmesi ve Gruplar Arası Karşılaştırması 56 4.7. TAS Sonuçlarının Değerlendirilmesi ve Gruplar Arası Karşılaştırması 58 4.8. TOS Sonuçlarının Değerlendirilmesi ve Gruplar Arası Karşılaştırması 59 5.TARTIŞMA 61 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 67 6.1. Sonuçlar 67 6.2. Öneriler 67 7.KAYNAKLAR 69 8. EKLER Ek 1. Orjinallik Ekran Çıktısı Ek 2. Dijital Makbuz 9.ÖZGEÇMİŞKARIMISAKHVIDI, N., Hidrojen peroksite maruz kalan fare Miyoblast hücre hattında oluşan atrofiye, melatonin uygulanmasının kalpain-1 ifadelenmesine ve atrofik morfolojiye etkisinin incelenmesi, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Fizyoloji Programı Doktora Tezi, Ankara, 2018. Kas atrofilerinin en sık görülen tipi olan kullanılmamaya bağlı kas atrofisinin oluşumunda oksidatif stresin temel etken olduğu bilinmektedir. Bu etkiyi ortadan kaldırmak amacı ile çalışılan çeşitli tedavi seçenekleri mevcuttur. Oksidatif stres ile oluşan en önemli ilk hasarın kalpain-1 gibi proteazlar ile oluşturulan kontraktil protein bütünlüğünün bozulması çeşitli araştırmalarda ortaya konmuştur. Oksidatif strese bağlı atrofiyi önlemede etkinliği gösterilen bir tedavi seçeneğide antioksidan uygulamalarıdır. Antioksidanlar içinde de melatonin gibi mitokondri hedefleyen antioksidanlar grubunun daha etkili bir tedavi seçeneği öne çıkmaktadır. Bizim çalışmamızda bu noktada literartüre ilk olarak melatonin uygulamasının kalpain-1 proteazının ifadesi üzerine etkisi ve melatoninin redoks dengeleri ve morfoloji üzerinde etkileri düzeyinde katkı sağlaması için planlanmıştır. Çalışmamızda oksidatif stres oluşturmak için H2O2 kullanıldı. Aynı koşullarda ve aynı pasaj sayısında olan C2C12 hücrelerinden 4 grup oluşturuldu. K (Kontrol), M (Melatonin), H (H2O2), M+H (Melatonin+ H2O2) grupları deney protokolünde belirtildiği gibi oluşturularak morfolojik değerlendirme için miyotüplerin çapları ölçüldü. Morfolojik değerlendirmede gruplar arasında anlamlı farklılık gösterildi (p