Meme Kanserinde Hedeflenmiş Metabolitlerin LC-MS/MS Yöntemi ile Tayinleri

The best preventive method for breast cancer, which accounts for 18% of the most common cancer-related deaths among women, is the early diagnosis. Metabolomic analyzes have an important role in early diagnosis and tracking of the disease progress. Untargeted metabolomic studies are aimed to find new markers for disease diagnosis in while targeted metabolomics are aimed quantitative determinations of selected markers with high accuracy and reproducibility. In the study, targeted metabolomic analyzes for twenty-six metabolites which were proposed in the literature for early diagnosis of breast cancer were performed in plasma samples of 105 healthy volunteers, 172 early stage and 92 metastatic breast cancer patients. For this purpose, a liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS) methodwas developed, validated and applied to control and patient plasma samples. As a result of the analyzes, it was observed that the amounts of glutamic acid, malic acid, glyceric acid, 3-hydroxybutyric acid, glutamine, proline, choline, fumaric acid, lactic acid, fumaric acid/glutamic acid and malic acid/glutamic acid changed in breast cancer patients. These metabolites are recommended for use as biomarkers in the early diagnosis of breast cancer.TÜBİTAK 1001 Projesi (114Z390) TÜBİTAK 2214-A Yurt Dışı Doktora Sırası Araştırma Burs ProgramıONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xii ŞEKİLLER xiv TABLOLAR xvi 1. GİRİŞ ve AMAÇ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Meme Kanserinde Anatomik Yapı, Evreleme ve Epidemiyoloji 3 2.2. Meme Kanserinde Tanı ve Tarama Yöntemleri 4 2.3. Omik Bilimler 6 2.3.1. Genomik 7 2.3.2. Transkriptomik 8 2.3.3. Proteomik 9 2.3.4. Metabolomik 10 2.4. Metabolomik Uygulamalar 12 2.4.1. Numune Hazırlama 13 2.4.2. Metabolomik Analiz Yöntemleri 14 2.4.3. Veri Analizi 28 2.5. Metabolitler 29 2.5.1. Biyobelirteç Olarak Metabolitler 29 2.5.2. Hedeflenen Metabolitler 29 2.6. Analitik Yöntem Validasyonu 38 2.6.1. Validasyon Parametreleri 38 2.7. Kaynak Özeti 39 3. GEREÇ VE YÖNTEM 43 3.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler 43 3.2. Kullanılan Cihazlar 44 3.3. Kullanılan Sarf Malzemeler 44 3.4. Kullanılan Yazılım ve Veri Bankaları 45 3.5. Çözeltilerin Hazırlanması 45 3.6. Etik Kurul İzni 47 3.7. Plazma Örneklerinin Toplanması ve Saklanması 47 3.8. Analiz Yöntemi 48 3.8.1. Optimizasyon Çalışmaları 48 3.8.2. Analiz Koşulları 51 3.9. Yöntemin Plazma Örneklerine Uygulanması 52 3.9.1. Plazma Kalibrasyon Standartlarının Hazırlanması 52 3.9.2. Kalibrasyon Grafiklerinin Oluşturulması 54 3.9.3. Yöntemin Gerçek Numunelere Uygulanması 54 3.10. Analitik Yöntem Validasyonu 55 3.10.1. Seçicilik 55 3.10.2. Duyarlılık 55 3.10.3. Doğrusallık 55 3.10.4. Kesinlik 56 3.10.5. Doğruluk 56 3.10.6. Geri Kazanım 56 3.10.7. Kararlılık 57 3.11. Sistem Uygunluk Testi (SUT) 58 3.12. Veri Analizi 58 4. BULGULAR 59 4.1. Analiz Yönteminin Geliştirilmesi 59 4.1.1. Optimizasyon Çalışmaları 59 4.2. Analitik Yöntem Validasyonu 73 4.2.1. Seçicilik 73 4.2.2. Doğrusallık 73 4.2.3. Duyarlılık 81 4.2.4. Kesinlik 82 4.2.5. Doğruluk 82 4.2.6. Geri Kazanım 84 4.2.7. Kararlılık 86 4.3. Sistem Uygunluk Çalışması 88 4.4. Yöntemin Gerçek Numunelere Uygulanması 88 4.5. Veri Analizi 90 4.5.1. Yolak Analizi 97 4.5.2. Biyobelirteç Analizi 98 5. TARTIŞMA 103 6. SONUÇ ve ÖNERİLER 116 7. KAYNAKLAR 118 8. EKLER EK 1. Etik Kurul İzni EK 2. Onam Formu EK 3. İstatistiksel Katsayıların Hesaplanması EK 4. Orjinallik Raporu Örneği EK 5. Dijital Makbuz 9. ÖZGEÇMİŞKadınlar arasında en sık görülen ve kansere bağlı ölümlerin % 18’ini oluşturan meme kanserinde en iyi koruyucu yöntem erken tanıdır. Metabolomik analizler erken tanıda ve hastalığın takibinde önemli rol almaktadırlar. Hedeflenmemiş metabolomik çalışmalarda hastalık tanısı için yeni belirteçlerin bulunması; hedeflenmiş metabolomikte ise seçilmiş belirteçlerin miktar tayinlerinin yüksek kesinlikte ve tekrarlanabilirlikte gerçekleştirilmesi amaçlanmaktadır. Bu çalışmada, kaynaklarda meme kanserinin erken teşhisi için önerilen yirmi altı metabolit seçilerek analizleri yapılmıştır. Hedeflenmiş metabolomik analizler 105 sağlıklı gönüllü, 172 erken evre ve 92 metastatik evredeki meme kanseri hastasına ait plazma örneklerinde gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometrisi (LCMS/MS) yöntemi geliştirilmiş ve valide edilmiştir. Analizler sonucunda glutamik asit, malik asit, gliserik asit, 3-hidroksibütirik asit, glutamin, prolin, kolin, fumarik asit, laktik asit, fumarik asit/glutamik asit ve malik asit/glutamik asit miktarlarının meme kanseri hastalarında önemli oranda değiştiği görülmüştür. Bu metabolitler meme kanserinin erken tanısında biyobelirteç olarak kullanılmak üzere önerilmektedir