İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi İçin TiO2 Bazlı Sabit Fazların Sentezi ve Biyomolekül İzolasyonunda Kullanımı

A titania based sorbent was developed for His-tagged protein purification by immobilized metal affinity chromatography (IMAC). The synthesis of monodisperse porous titania microbeads ca 5 m in size was performed by a staged shape template sol-gel method using poly(3-chloro-2-hydroxypropyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate) poly(HPMA-Cl-co-EDMA) microbeads as the template material. Iminodiacetic acid-3-glycidoxypropyl trimethoxysilane complex (IDA-GLYMO) was covalently attached onto the titania microbeads via silanization reaction. Ni2+ ions were then attached to the derivatized microbeads via metal-chelate complex formation with the carboxyl groups on the microbeads. The developed sorbent was used for the isolation of histidine-rich proteins in batch affinity system. For this purpose, the isolation of bovin hemoglobin (BHb) as a histidine-rich protein and bovine serum albumin (BSA) as a reference protein were comparatively investigated using Ni2+ attached-monodisperse-porous titania microbeads as the sorbent in batch fashion. The maximum equilibrium BHb adsorption was determined as 140 mg BHb per g sorbent. BHb could be isolated with quantitative desorption yield in the aqueous buffer medium. Although the selected reference, BSA exhibited a limited equilibrium adsorption, it could not be eluted from the sorbent with high yield. The developed sorbent was also used for isolation of hemoglobin from human blood in micro-immobilized metal affinity chromatography (MIMAC) systems in batch and continuous system, and Hb was isolated with ≥95 and 85% purity, respectively, in batch and MIMAC systems. The results show that the developed sorbent allows isolation with high selectivity and high efficiency for histidine-rich protein BHb.İÇİNDEKİLER ÖZET i TEŞEKKÜR v İÇİNDEKİLER vi ÇİZELGELER ix ŞEKİLLER x SİMGELER VE KISALTMALAR xiii 1.GİRİŞ 1 2. LİTERATÜR ÖZETİ 5 2.1. Proteinlerin Saflaştırma Yöntemleri 5 2.2. Afinite Kromatografisi 7 2.3. İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi (IMAC) 9 2.3.1. Katı Destek Olarak Kullanılan Matriksler 12 2.3.2. Ligandlar 13 2.3.3. Ligandlar Üzerine İmmobilize Olan Metal İyonları 16 2.3.4. Kromatografik Sorbentler ile Adsorpsiyon-Desorpsiyon Mekanizması 17 2.3.5. İmmobilize Metal Afinite Kromatografisinin Avantajları ve Dezavantajları 19 2.4. Titanyum dioksit 20 2.4.1. TiO2 Sentez Yöntemleri 21 2.4.2. Sol-Jel Yöntemi 22 2.4.2.1 Düşük-Sıcaklık Sol-Jel Prosesi 23 2.4.2.2. Sol-Jel Kalıplama Yöntemi 24 2.5. Polimerizasyon Yöntemleri 24 2.5.1. Dispersiyon Polimerizasyonu 24 2.5.2. Çok Basamaklı Mikrosüspansion Polimerizasyonu 27 2.6. Adsorpsiyon İzotermi 28 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 29 3.1. Materyal 29 3.2. İmmobilize Metal Afinite Kromatografi (IMAC) Uygulamaları İçin Monodispers-Gözenekli TiO2 Mikroküre Bazlı Sorbent Sentezi 30 3.2.1. Dispersiyon Polimerizasyonu Yöntemi İle Çıkış Lateksinin (poli(GMA)) Sentezi……. 30 3.2.2. Çok Basamaklı Mikrosüspansiyon Polimerizasyonu Yöntemi İle Kalıp Materyalinin (poli(HPMA-Cl-co-EDMA)) Sentezi 31 3.2.3. Sol-Jel Kalıplama Yöntemi İle TiO2 Mikrokürelerin Sentezi 32 3.2.4. TiO2 Mikroküreler üzerine IDA-GLYMO Bağlanması 33 3.2.5. IDA-GLYMO Bağlı TiO2 Mikroküreler Üzerine Ni2+ İyonlarının İmmobilize Edilmesi……. 34 3.3. Monodispers-Gözenekli TiO2 Mikroküre Bazlı Sorbentlerin Karakterizasyonu 35 3.3.1. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) 35 3.3.2. Yüzey Alanı Ölçümü (BET) 36 3.3.3. X-ray Fotoelektron Spektroskopisi (XPS) 36 3.4. Kesikli Sistemde Protein İzolasyonu 36 3.4.1. Materyal 37 3.4.2. Kesikli Sistemde Sorbent Miktarı Değişiminin Protein İzolasyonuna Etkisi 37 3.4.3. Kesikli Sistemde Başlangıç Protein Konsantrasyonu Değişiminin Protein İzolasyonuna Etkisi 39 3.4.4. Tekrar Kullanılabilirlik 39 3.5. Kesikli ve Sürekli Mikroakış Sisteminde İnsan Tam Kan Örneğinden Hb İzolasyonu…… 39 3.5.1 Kesikli Sistemde İnsan Tam Kan Örneğinden Hb İzolasyonu 39 3.5.2 Sürekli Sistemde İnsan Tam Kan Örneğinden Hb İzolasyonu 40 3.5.2.1. Sürekli Mikroakış Sistemi Özellikleri ve TiO2 Bazlı Mikrokürelerle Dolgulanması. 40 3.5.2.2. Sürekli Mikroakış Sisteminde Hb İzolasyonu 41 3.5.3. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) 42 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 44 4.1. Monodispers-Gözenekli TiO2 Mikrokürelerin Karakterizasyonu 44 4.2. Monodispers-Gözenekli TiO2 Mikroküreler Yardımıyla Kesikli Sistemde Protein İzolasyonu 48 4.2.1. Sorbent Miktarı Değişiminin Protein İzolasyonuna Etkisi 48 4.2.2. Başlangıç Protein Konsantrasyonu Değişiminin Protein İzolasyonuna Etkisi 50 4.2.3. Mikroküre Türünün Başlangıç Protein Konsantrasyonu Değişimi İle Protein İzolasyonu Üzerindeki Etkisi 52 4.2.4. Ni2+-IDA-GLYMO@TiO2 Mikrokürelerin Tekrar Kullanılabirliğinin İncelenmesi 56 4.3. Monodispers-Gözenekli TiO2 Bazlı Mikroküreler Yardımıyla Kesikli Sistem ve Sürekli Mikroakış Sisteminde İnsan Tam Kan Örneğinden Hb İzolasyonu 57 5. SONUÇLAR 61 KAYNAKLAR 64 ÖZGEÇMİŞ 71İmmobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) ile histidin etiketli protein saflaştırılması için titanyum dioksit bazlı yeni bir sorbent geliştirilmiştir. Monodispers gözenekli formda, 5 m boyutundaki titanyum dioksit mikrokürelerinin sentezi, kalıp malzemesi olarak poli (3-kloro-2-hidroksipropil metakrilat-ko-etilen glikol dimetakrilat) (poli (HPMA-Cl-co-EDMA)) mikroküreleri kullanılarak, sol-jel kalıplama yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Silanizasyon reaksiyonu ile, iminodiasetik asit-3-glisidoksipropil trimetoksisilan kompleksi (IDA-GLYMO) titanyum dioksit mikrokürelerinin üzerine kovalent olarak bağlanmıştır. Bu mikroküreler üzerinde bulunan karboksil grupları üzerinden metal-şelat kompleksi oluşumu ile Ni2+ iyonları mikrokürelere bağlanmıştır. Geliştirilen sorbent, histidin açısından zengin proteinlerin kesikli sistemde immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) yöntemiyle izolasyonu için kullanılmıştır. Bu amaçla, histidin açısından zengin bir protein olan bovin hemoglobinin (BHb) ve referans protein olarak seçilen bovin serum albümin (BSA)'in izolasyonu, Ni2+ bağlı-monodispers gözenekli titanyum mikrokürelerin (Ni2+-IDA-GLYMO@TiO2) sorbent olarak kullanılmasıyla kesikli sistemde karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Maksimum denge BHb adsorpsiyon kapasitesi, 140 mg BHb/g mikroküre olarak belirlenmiştir. BHb, sulu tampon ortamında kantitatif desorpsiyon verimi ile izole edilmiştir. Referans olarak seçilen BSA, sınırlı bir denge adsorpsiyonu göstermiş olmasına rağmen, sorbentten yüksek verimle desorplanmamıştır. Geliştirilen sorbent aynı zamanda kesikli ve sürekli formdaki mikro-immobilize metal affinite kromatografisi (MIMAC) sistemlerinde insan kanından hemoglobin izolasyonu için kullanılmış, kesikli ve MIMAC sistemlerde sırasıyla ≥95 ve %85 saflık oranında Hb izole edilmiştir. Sonuçlar, geliştirilen sorbentin histidin açısından zengin protein olarak seçilen BHb için yüksek seçicilik ve yüksek verimle izolasyona imkan verdiğini ortaya koymuştur