Çocukluk Dönemi Steroide Dirençli Nefrotik Sendroma Sebep Olan Yeni Genlerin Bulunması

Steroid resistant nephrotic syndrome (SRNS), despite being a rare disease, is the second most common cause of end stage kidney failure in childhood and early adulthood. However the heterogeneity and rarity (<1%) of disease causing genes cause significant limitations in identification of a new gene. In this thesis work, identification of a novel gene is aimed via a new approach which combines total genome homozygosity mapping technique with whole human exome capture and massively parallel re-sequencing techniques. 2056 families consisting the cohort were screened via direct DNA sequencing for mutations in NPHS1, NPHS2, LAMB2, PLCE1 and WT1 genes that are known to cause SRNS at a high proportion and the cause of SRNS is identified in 310 families. Out of the remaining 1746, 85 families with known parental consanguinity were chosen to be analyzed by total genome homozygosity mapping technique via Affymetrix 250K (StyI) SNP chip. In homozygosity analysis, the presence of two or more siblings affected by the disease aids in the narrowing of the homozygous segments that are believed to harbor the disease causing gene, therefore 19 families that have multiple affected siblings were chosen among 85 families. One family (A2410) drew attention based on ethnic roots, clinical properties and response to treatment properties amongst 19 families and analyzed with whole human exome capture and massively paralel re-sequencing. Non parametric LOD scores were calculated together for siblings A2410-21 and A2410-22 and cZLR peaks pointing homozygosity by descent were found on chromosomes 3, 10, 14, 17, 21 and 22. Whole human exome capture and massively paralel re-sequencing showed 1968 variants from reference sequence and 48 of them were found not to be SNP?s by comparing to the databases. 11 out of these 48 were found to be non-synonymous changes and harboring in the homozygous segments. Only one of these variants was an insertion/deletion variation. Therefore one basepair homozygous deletion in CUBN (Cubilin) gene exon 53 (c.8355delA) was found that leads to early termination of protein (p.S2785fsX19) via causing a frameshift mutation. The presence of the mutation in homozygous state in affected siblings and in heterozygous state in the parents were shown by direct DNA sequencing. The absence of the mutation in healthy controls was verified by comparison with 1000 genome database. Also the mutation was not found when 92 healthy Turkish control individuals that are ethnic matching to Egyptian population were analyzed by DNA sequencing.Steroide dirençli nefrotik sendrom (SDNS) nadir bir hastalık olmakla birlikte çocukluk ve genç erişkinlik döneminde son dönem böbrek yetmezliğinin en sık ikinci sebebidir. Ancak genetik heterojenitenin varlığı ve hastalığın nadir gözlenmesi (<%1), yeni bir genin bulunmasına ciddi sınırlamalar getirmektedir. Tez çalışmasında, homozigotluk haritalaması tekniği (total genome homozygosity mapping) ile eksom saptama (whole human exome capture) ve yüksek ölçekli dizileme (massively parallel re-sequencing) tekniklerinin birleştirildiği bir yaklaşım ile yeni genlerin bulunması hedeflenmiştir. Hasta grubunu oluşturan 2056 aile, SDNS'e yüksek oranda sebep olduğu bilinen NPHS1, NPHS2, LAMB2, PLCE1 ve WT'deki mutasyonlar açısından DNA dizi analizi ile taranmış ve 310 ailenin hastalık sebebi bu genlerdeki bir mutasyonla aydınlatılmıştır. Geri kalan 1746 aile arasından seçilen ve ebeveynler arasında akrabalık olduğu bilinen 85 aile homozigotluk haritalaması tekniği kullanılarak Affymetrix 250K (StyI) SNP çip ile taranmıştır. Homozigotluk analizlerinde hastalıktan etkilenen iki veya daha fazla çocuğun olmasının, hastalığa sebep olduğu düşünülen geni içeren homozigot bölgenin daraltılmasına yardımcı olması nedeniyle, bu 85 aile arasından birden fazla hastalıktan etkilenen kardeşin olduğu 19 aile seçilmiştir. Bu 19 aile arasından bir aile (A 2410) etnik kökeni, klinik bulguları ve tedaviye cevap özellikleri açısından dikkat çekmiş ve eksom saptama ve yüksek ölçekli dizileme ile analiz edilmiştir. A2410-21 ve A2410-22 kardeşleri için parametrik olmayan LOD değerleri, iki kardeş birlikte hesaplanmış ve kromozom 3, 10, 14, 17, 21 ve 22'de ortak atadan kalıtılan homozigotluğu işaret eden cZLR peak'leri bulunmuştur. Eksom saptama ve yüksek ölçekli dizileme, referans diziden farklı 1968 varyant göstermiştir. Sonuçlar veri bankalarıyla karşılaştırıldığında bu varyantların 48 tanesinin SNP olmadığı saptanmıştır. Bu 48 varyant arasından 11 tanesinin sinonim olmadığı ve homozigot segmentlere yerleşmiş olduğu bulunmuştur. Bu varyantlardan sadece bir tanesi insersiyon/delesyon varyasyonudur. Bu sayede CUBN (Cubilin) geninin 53'üncü eksonunda bir bazçiftlik homozigot delesyonun (c.8355delA) çerçeve kaymasına neden olarak kodlanan proteinin erken sonlandırılmasından (p.S2785fsX19) sorumlu olduğu bulunmuştur. DNA dizi analiziyle mutasyonun hastalıktan etkilenen kardeşlerde homozigot; ebeveynlerinde ise heterozigot olarak varlığı gösterilmiştir. 1000 Genom Projesi veri bankasıyla karşılaştırılarak mutasyonun kontrol bireylerde olmadığı görülmüştür. Ayrıca Mısır populasyonuna etnik olarak eş olan sağlıklı 92 Türk bireyi kontrol amacıyla DNA dizi analizi ile incelenmiş ve bu bireylerde mutasyon bulunmamıştır