Kistik Fibrozis Hastalarının Alevlenme ve Remisyon Dönemleri Plazma Sfingomyelin ve Seramid Düzeylerinin Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi ile Belirlenmesi ve Bazı İnflamasyon Belirteçleriyle İlişkisinin İncelenmesi

Cystic fibrosis (CF) is the most common autosomal recessive genetic disorder of caucaisan population. Despite the multisystemic involvement in CF, increased mucus viscosity in the lungs, deterioration of mucociliary clearance and consequent chronic lung infections are the most common causes of mortality. There are many hypotheses about the pathogenesis of CF lung disease. CF’s relationship with lipids is not understood. Sphingomyelin (SM) and ceramide (C) are sphingolipid metabolites which play a role in many cellular events. Disorders in lipid metabolism have been linked to the pathogenesis of many diseases, but it has not been elucidated in which pathophysiological processes and how C and SM are involved. YKL-40 is a chitinase-like glycoprotein secreted from macrophages. It is physiological role is not known yet. It is thought to have been involved in chronic inflammation. Chitotriosidase can also be evaluated as an inflammatory protein because it is secreted from active macrophages. Plasma samples were obtained from whole blood collected from CF patients who were hospitalized with pulmonary exacerbation during exacerbation, discharge after antibiotic treatment and control within the first 3 months after discharge period. In these plasma samples, YKL-40 and chitotriosidase activities were measured in order to evaluate the level of inflammation. C and SM levels were measured in order to observe changes of sfingolipid metabolites during disease course. The results were compared to healthy individuals of similar age range. Except the 16 SM level of the control of the adult CF patient group; all plasma SM and C levels in exacerbation, discharge and control were significantly lower when compared to healthy controls (p<0.001 and p<0.05). For the children with CF in exacerbation 16 SM, 18 SM, 24 SM, C 22, C 24, in discharge 18 SM, 24 SM, C 18, C 20, C 22, C 24 and control period 18 SM, 24 SM, C 24 levels were significantly lower than healthy controls (p<0.001/p<0.05). YKL-40 levels of adult and pediatric CF patients were significantly higher than healthy controls at all periods (p<0.001/p<0.05). In addition, FVC and FEV1 values of pediatric patients (FVC: r:-0.70, p<0.05/FEV1: r:-0.72, p<0.05) and adult CF patients with FEV1≤50 (FVC: r:-0.64, p<0.05/FEV1: r:-0.64, p<0.05) in exacerbation period were found to correlate negatively with YKL-40 levels in the same period. The chitotriosidase activities of adult CF patients were significantly higher than healthy controls at all periods (p<0.001/p<0.05), the chitotriosidase activities of pediatric CF patients were not significantly different from healthy controls in any of the periods. C, SM and YKL-40 levels and chitotriosidase activities did not show any significant difference between the periods of the disease According to our data, it is clear that the sphingolipid metabolism changes as a result of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) mutation. It is known that CFTR disorder impairs vesical pH acidification and reduces the activity of acidic sphingomyelinase (Smase), which is active at acidic pH. For this reason, C and SM production may be restricted in CF patients. The glutathione (GSH) transporter is CFTR dependent. In CFTR mutant cell lines GSH levels are shown to be higher than normal cells. Another study showed that high levels of GSH inhibited C production in the lungs. High intracellular GSH concentrations in CF according to the literature may be leading to a decrease in C synthesis via Smase pathway. Significant differences in SM and C types compared to healthy controls are more pronounced in adult patients than children. This can be explained by the fact that adult patients are more exposed to the burden of chronic illness due to their older age, and thus their sphingolipid metabolism may be more affected. Chitotriosidase activity was significantly higher in all periods of adult patients than in healthy controls, but not significantly different in children compared to healthy controls. This suggests that chitotriosidase activity reflects chronic inflammation better in older patients. YKL-40 was found to be significantly higher in both adult and pediatric patients than healthy control in all three periods, and negative correlation with pulmonary function tests suggests that YKL-40 may be valuable in following pulmonary function in CF patients. C, SM and YKL-40 levels and chitotriosidase activities do not differ significantly between the periods of the disease suggests that the research should be done with more patients besides the result that would not be beneficial for the follow-up of the disease.TEŞEKKÜR iii ÖZET iv ABSTRACT v 1. GİRİŞ ve AMAÇ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Kistik Fibrozis (KF) 4 2.1.1. Kistik Fibrozis ile İlgili Genel Bilgiler 4 2.1.2. Pulmoner Semptomlar 6 2.1.3. Gastrointestinal Semptomlar 7 2.1.4. Kistik Fibrozis Geni 9 2.1.5. KFTR Proteini 10 2.1.6. KF’in Tanısı 13 2.1.7. KF Tedavisi 20 2.2. Sfingolipitler 27 2.2.1. Sfingolipitlerin sentezi 27 2.2.2. Seramidler 28 2.2.3. Sfingomyelinler 30 2.2.4. Lipit Raftları 31 2.3. Sfingolipitler ve Hastalıklar 32 2.3.1. Seramidler ve Apoptoz 33 2.3.2. Seramidler ve İnflamasyon 33 2.3.3. Seramidlerin Tedavideki Rolü 34 2.3.4. Likit kromatografi–Tandem Kütle Spektrometresi 36 2.4. Kitin 41 2.5. Kitinazlar ve Kitinaz Benzeri Proteinler 41 2.5.1. Kitotriozidaz Aktivitesi 42 2.5.2. YKL-40 42 3. GEREÇ ve YÖNTEM 44 3.1. Gereçler 44 3.1.1. Kullanılan Kimyasal Bileşikler 44 3.1.2. Kullanılan Cihazlar ve Diğer Malzemeler 45 3.2. Çalışma Gruplarının Oluşturulması 45 3.3. Kan Örneklerinin Alınması ve Saklanması 47 3.4. Yöntemler 47 3.4.1. Seramid ve Sfingomyelinlerin Analizi 47 3.4.2. Kitotriozidaz Enzim Aktivite Tayini 53 3.4.3. YKL-40’ın Ölçüm Prensibi 55 4. BULGULAR 59 4.1. Demografik, Klinik ve Rutin Biyokimyasal Veriler 59 4.2. Seramid ve Sfingomyelinlerin LC-MS/MS ile Analiz Sonuçları 62 4.2.1. Erişkin KF Hastaları ile Sağlıklı Bireylerin Sonuçları 62 4.2.2. Çocuk KF Hastaları ile Sağlıklı Bireylerin Sonuçları 67 4.3. YKL-40 Sonuçları 72 4.3.1. Erişkin KF Hastaları ile Sağlıklı Bireylerin Sonuçları 72 4.3.2. Çocuk KF Hastaları ile Sağlıklı Bireylerin Sonuçları 73 4.4. Kitotriozidaz Aktivitesi Sonuçları 74 4.4.1. Erişkin KF Hastaları ile Sağlıklı Bireylerin Sonuçları 74 4.4.2. Çocuk KF Hastaları ile Sağlıklı Bireylerin Sonuçları 76 4.5. KF Hastalarının Alevlenme Dönemleri SER, SM ve YKL-40 Düzeyleri ile Kitotriozidaz Aktivitelerinin Klinik/Rutin Biyokimyasal Parametrelerle Korelasyon İlişkileri 77 5. TARTIŞMA 80 6. SONUÇLAR ve ÖNERİLER 88 7. KAYNAKLAR 89 EKLER 116 EK 1. Onam Formları 116 EK 2. Muayene Takip Formları 128 EK 3. Çalışmadan Hazırlanan Yazılı ve Sözlü Sunumlar 131Kistik fibrozis (KF); beyaz ırkın en sık rastlanan otozomal resesif geçişli genetik hastalığıdır. KF’de multisistemik bir tutulum olmasına rağmen, akciğerlerde mukus viskozitesinin artması, mukosiliyer klirensin bozulması ve buna bağlı meydana gelen kronik akciğer infeksiyonları mortalitenin en sık sebebidir. KF akciğer hastalığı patogenezi hakkında birçok hipotez vardır. Lipitlerle olan ilişkisi ise anlaşılamamıştır. Sfingolipit metabolitlerinden olan sfingomyelin (SM) ve seramid (SER)’ler birçok hücresel olayda rol oynar. Lipit metabolizmasındaki bozukluklar birçok hastalığın patogeneziyle ilişkilendirilmiş ancak, SER ve SM’lerin hangi patofizyolojik süreçlerde ve nasıl rol aldıkları aydınlatılamamıştır. YKL-40, makrofajlardan salgılanan kitinaz benzeri bir glikoproteindir. Fizyolojik rolü tam bilinmemektedir. Kronik inflamasyonda rol aldığı düşünülmektedir. Kitotriozidaz da aktif makrofajlardan salgılandığı için inflamatuvar bir protein olarak değerlendirilebilir. KF tanısı almış hastalardan, pulmoner alevlenmeyle servise yatışı yapılan hastaların alevlenme, antibiyotik tedavisi sonrası taburculuk dönemi ile taburcu olduktan sonra ilk 3 ay içindeki kontrole geldiklerinde alınan tam kan örneklerinden elde edilen plazmalarda, hastalık seyri boyunca sfingolipit metabolitleri ile inflamasyon düzeyini değerlendirmek amacıyla YKL-40 ve kitotriozidaz aktiviteleri ölçüldü. Sonuçlar benzer yaş aralığındaki sağlıklı bireylerle kıyaslandı. Erişkin KF hastalarının alevlenme ve taburculuk dönemi tüm SM ve SER düzeyleri ile kontrol dönemi 16 SM hariç tüm SM ve SER düzeyleri sağlıklı kontrole göre anlamlı düşük bulundu ( p<0,001 ve p<0,05). Çocuk KF hastalarının alevlenme dönemi 16 SM, 18 SM, 24 SM, SER 22 ve SER 24, taburculuk dönemi 18 SM, 24 SM, SER 18, SER 20, SER 22 ve SER 24 ile kontrol dönemi 18 SM, 24 SM ve 24 SER düzeyleri sağlıklı kontrole göre anlamlı düşük bulundu (p<0,001 ve p<0,05). Erişkin ve çocuk KF hastalarının YKL-40 düzeyleri tüm dönemlerde sağlıklı kontrole göre anlamlı yüksek bulundu (p<0,001 ve p<0,05). Ayrıca erişkin KF hastalarının alevlenme dönemi FEV1≤50 olanların FVC (r:-0,64 ve p<0,05) ve FEV1 (r:-0,64 ve p<0,05) değerleri ile çocuk hastaların alevlenme dönemi FVC (r:-0,70 ve p<0,05) ve FEV1 (r:-0,72 ve p<0,05) değerleri aynı dönem YKL-40 düzeyleri ile negatif yönde korele bulundu. Erişkin KF hastalarının kitotriozidaz aktiviteleri tüm dönemlerde sağlıklı kontrole göre anlamlı yüksek iken (p