PATOJENİK BAKTERİLERİN TANISI İÇİN NANOESASLI SENSOR PLATFORMLARI

In the first part of this study, chitosan-graft-PCL (CS-g-PCL) copolymers and PCL polymer were synthesized. For grafting of PCL oligomers on the chitosan chains, chitosan was dissolved in acidic solvent (Methane sulfonic acid) under N2 atmosphere, then ε-caprolactone monomers was added to the solution. Grafting reaction initiated in acidic condition and ended after 5 hours. In this part two different CS-g-PCL copolymers with different proportion of chitosan and ε-caprolactone were synthesized. Synthesizing of PCL polymer was carried out by use of the ring opening polymerization. ε-caprolactone in pyrex tube heated up to 110 ̊C under N2 atmosphere, after that Sn(Oct)2 was added as catalyzer and put in oven at 120 ̊C for 24 hours. Synthesized copolymers and PCL were characterized with FTIR, 1HNMR, GPC and TGA. Results of characterization described that the synthesize procedures were done successfully. Molecular weights of copolymers and PCL were obtained. Then, different blends of PCL with each of the copolymers were prepared in the chloroform and N,N-dimethylformamide as a solvent system. PCL and Blend solutions were used to prepare nanofibers with electrospinning. Two different types of electrospinning system were used to prepare nanofibers. In the first part, conventional electrospinning system with syringe and rotating collector was used to produce nanofibers. In the second part, nanospider electrospinning machine produced with Elmarco Co. was used for electrospinning process. Surface chemistry, hydrophilic and hydrophobic character and mechanic strength of nanofiber matrices were characterized with XPS (X-ray Photoelectron Spectroscopy), water contact angle and mechanic tests respectively. Antibacterial activity of the nanofiber matrices were studied with use of two different bacteria as gram positive and gram negative bacteria. Also the formation of biofilm on the surface of nanofiber matrices was studied. Sonochemical reduction method was used for reduction of gold and silver nanoparticles on the surface of the nanofiber matrices, and for comparison, deposition of synthesized gold nanoparticles on the surface of the nanofiber matrices with use of sonication was done in parallel with sonochemical reduction procedure. SEM image of prepared nanofiber matrices and nanofibers doped with gold and silver particles, were obtained and showed successful preparation of matrices. Raman spectroscopy was used to study the surface enhanced (SERS) properties of doped gold and silver nanoparticles on the surface of nanofiber matrices. Then the effect of nanofiber matrices with highest SERS peaks on gram negative bacteria (E. coli ATCC 25922) studied with fluorescence microscope.İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET i ABSTRACT iii TEŞEKKÜR v İÇİNDEKİLER vi ÇİZELGELER ix ŞEKİLLER x SİMGELER VE KISALTMALAR xv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Kitin ve Kitosan 4 2.1.1. Kitinin Morfolojisi 4 2.1.2. Kitosan 5 2.1.3. Kitosanın Karakterizasyonu ve Çözünürlüğü 6 2.1.4. Kitosan Esaslı Maddelerin İşlenmesi ve Ana Özellikleri 8 2.1.5. Kimyasal Yapı ve Biyolojik Aktiviteler Arasındaki İlişki 9 2.1.6. Kitosanın Antimikrobiyal Aktivitesi 10 2.2. Polikaprolakton (PCL) 12 2.2.1. PCL Sentezi ve Fiziko-Kimyasal Özellikleri 13 2.2.2. PCL’nin Biyodegradasyonu 15 2.2.3. PCL Nanofiberleri 16 2.3. PCL/Kitosan Nanofiberleri 17 2.4. Elektroeğirme (Elektrostatik Eğirme) 18 2.5. Sonokimyasal İndirgeme Yöntemiyle Yüzey Zenginleştirme 22 2.6. Yüzey Zenginleştirilmiş Raman Spektroskopisi (SERS) 24 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 27 3.1. Çalışmanın Temeli ve Kapsamı 27 3.2. Kullanılan Malzemeler 27 3.3. Graft Kopolimerler ve PCL’nin Sentez ve Karakterizasyonu 28 3.3.1. Graft Kopolimerlerin (CS-g-PCL-I ve CS-g-PCL-II) Sentezi 28 3.3.2. Polikaprolaktonun (PCL’nin) Sentezi 29 3.3.3. Polimerlerin Fourier Dönüşümlü Kızılötesi (FTIR) Analizi 30 3.3.4. Polimerlerin Hidrojen Nükleer Manyetik Rezonans (1H-NMR) Analizi 30 3.3.5. Polimerlerin Jel Geçirgenlik Kromatografisi (GPC) Analizi 30 3.3.6. Polimerlerin Termogravimetrik Analizi (TGA) 30 3.4. Elektroeğirme ile PCL ve Kopolimerler Karışımı Fibelerin Üretilmesi 31 3.4.1. Şırıngalı Elektroeğirme Sistemiyle Nanofiber Matris Üretimi 32 3.4.2. ELMARCO Nanospider Cihazı ile Nanofiber Matris Üretimi 35 3.4.3. Nanospider ™ Teknolojisi 35 3.4.4. Nanofiber Matrislerin Su Temas Açısı Deneyleri 36 3.4.5. X-ışını Fotoelektron Spektroskopisi (XPS) ile Yüzey Kimya Analizi 37 3.4.6. Matrislerin Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile Görüntülenmesi 38 3.4.7. Nanofiber Matrislerin Gerilme-Uzama Deneyi 39 3.5. Antimikrobiyal Testler 40 3.5.1. Agar Difüzyon Testleri 41 3.6. Biyofilm Oluşumu Deneyleri 41 3.6.1. S. epidermidis Biyofilm Oluşumu Deneyleri 42 3.6.2. S. epidermidis Biyofilminin Optik Mikroskop Görüntüleri 43 3.7. Turkevich Yöntemiyle Altın Nanopartikül (AuNP) Sentezi 43 3.7.1. AuNPlerin Morötesi–Görünür ( UV-Vis ) Analizi 44 3.7.2. AuNPlerin Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM) Görüntüleri 44 3.8. Sonikasyon Yöntemiyle Nanofiber Yüzeylerine Nanopartikül Yüklenmesi 44 3.8.1. Sonokimyasal İndirgeme ile Nanofiber Yüzeylerine AgNP Yüklenmesi 45 3.8.2. Sonokimyasal İndirgeme ile Nanofiber Yüzeylerine AuNP Yüklenmesi 46 3.8.3. AuNPlerin Sonikasyon ile Nanofiber Yüzeylerine Yüklenmesi 46 3.8.4. Yüzeylerine NP Yüklenen Nanofiberlerin SEM Görüntüleri 47 3.8.5. Yüzeylerine NP Yüklenen Nanofiberlerin Raman Analizi 48 3.9. NP Yüklenmiş Yüzeylerin Flüoresan Ölçumleri 48 4. DENEYSEL SONUÇLAR VE TARTIŞMA 50 4.1. Sentezlenen Graft Kopolimerler ve PCL’nin Karakterizasyonu 50 4.1.1. FTIR Sonuçları 50 4.1.2. 1H-NMR Sonuçları 52 4.1.3. GPC Sonuçları 55 4.1.4. TGA analiz sonuçları 57 4.2. Nanofiberlerin Karakterizzasyonu 59 4.2.1. Elektroeğirme ile Üretilen Kopolimerler ve PCL Karışımı Fibeler 59 4.2.2. Su Değme Açısı Analiz Sonuçları 59 4.2.3. X-ışını Fotoelektron Spektroskopisi (XPS) ve Yüzey Kimya Analizi 62 4.2.4. Nanofiberlerin SEM Görüntüleri ve Morfolojileri 64 4.2.5. Mekanik Test (Gerilme-Uzama Deneyi) Sonuçları 68 4.3. Antimikrobiyal Test (Agar Difüzyon Test) Sonuçları 70 4.4. Biyofilm Oluşumu Deney Sonuçları 70 4.4.1. S. epidermidis Biyofilm Oluşumu 70 4.4.2. S. epidermidis Biyofilminin Optik Mikroskop Görüntüleri 71 4.5. Turkevich Yöntemiyle Sentezlenen Aunpler Karakterizasyonu 72 4.5.1. AuNPlerin Morötesi-Görünür (UV-Vis) Spektrumu 72 4.5.2. AuNPlerin TEM Görüntüsü 73 4.6. Sonokimyasal İndirgeme ile Nanofiber Yüzeylerine Yüklenen NPlerin Optimizasyon Sonuçları: 73 4.6.1. İndirgeme Yöntemiyle Nanofiber Yüzeylerine AgNP Yüklenmesi 73 4.6.2. İndirgeme Yöntemiyle Nanofiber Yüzeylerine AuNP Yüklenmesi 76 4.6.3. AuNPlerinin Sonikasyon ile Nanofiber Yüzeylerine Yüklenmesi 78 4.7. Yüzeylerine NP Yüklenmiş Nanofiberlerin SEM Görüntüleri 80 4.7.1. AgNPleri İndirgenmiş Nanofiberlerin SEM Görüntüleri 80 4.7.2. AuNPleri İndirgenmiş Nanofiberlerin SEM Görüntüleri 83 4.7.3. Sonikasyon ile AuNPleri Yüklenmiş Nanofiberlerin SEM Görüntüleri 85 4.8. NP Yüklenmiş Nanofiber Fimlerinin RAMAN Spektrumları 87 4.8.1. İndirgeme ile AgNP Yüklenen Nanofiberlerin RAMAN Spektrumları 87 4.8.2. İndirgeme ile AuNP Yüklenen Nanofiberlerin RAMAN Spektrumları 88 4.8.3. Sonikasyon ile AuNPleri Yüklenen Nanofiberlerin RAMAN Spektrumları 89 4.8.4. NP Yükleme Sonuçlarının Değerlendirilmesi 90 4.9. Flüoresan Görüntüleme Sonuçları 91 5. GENEL SONUÇLAR 94 KAYNAKLAR 96 ÖZGEÇMİŞ 109Bu çalışmanın ilk kısmında Kitosan-g-PCL kopolimerleri ve PCL sentezlenmiştir. Oligo-PCL zincirlerinin kitosan zincirleri üzerinde graft edilmesi için kitosan azot atmosferi altında asidik ortamda (metansolfunik asit) çözündükten sonra ε-kaprolakton monmeri iki farklı oranda ortama ilave edilmiş ve iki farklı kitosan-graft-PCL kopolimerleri (CS-g-PCL I ve CS-g-PCL II) sentezlenmiştir. PCL sentezi için halka açılması polimerizasyonu kullanılmıştır. ε-kaprolakton monomeri payreks tüp içinde 110 ̊C sıcaklığa kadar ısıtıldıktan sonra 5 dakika boyunca azot atmosferi altında tutulmuş, monomerin 1/1000 (ağırlıkça) oranında kalay oktoat katalizör olarak ilave edilmiştir. Elde edilen karışım vorteks ile hemojenleştirilmiş, daha sonra 24 saat boyunca 120 ̊C’de bekletilerek PCL sentezi tamamlanmıştır. Sentezlenen polimerler FTIR, 1H-NMR, TGA ve GPC yöntemleri ile karakterize edilmiş ve polimerlerin başarılı bir şekilde sentezlendiği saptanmış ve molekül ağırlıkları elde edilmiştir. Daha sonra PCL’nin kopolimerlerle ayrı ayrı farklı oranlarda kloroform ve N,N-dimetilformamid çözücü sisteminde karışımları oluşturulmuş ve bu karışımlar iki farklı yöntem kullanılarak elektroeğirilmiş, PCL ve kitosan-graft-PCL-blend-PCL nanofiberleri oluşturulmuştur. Nanofiberlerin üretimi için kullanılan ilk yöntem geleneksel şırıngalı elektroeğirme yöntemdir. Kullanılan ikinci yöntem ise Elmarco şirketi tarafından üretilen Elmarco “Nanospider” cihazıdır. Nanofiberlerin yüzey kimyası, hidrofilik ve hidrofobik özellikleri, mekanik özellikler, morfolojileri ve fiberlerin çapları, sırasıyla XPS (X-ışını fotoelektron spektroskopisi), su temas açısı testi, mekanik test ve SEM ile incelenmiştir. Daha sonra nanofiberlerin antibakteriyel özellikleri gram pozitif ve gram negatif patojen bakteriler üzerinde incelenmiştir. Nanofiber matrisleri üzerinde biyofilm oluşumu deneyleri de gerçekleşmiştir. Son aşamada sonokimyasal indirgeme yöntemi ile nanofiber yüzeylerine farklı konsantrasyonlar kullanılarak altın ve gümüş partikülleri yüklenmiştir. Kıyaslama amacı ile önceden sentezlenen altın nanopartikülleri de sonikasyon yardımıyla nanofiber matrisleri üzerine yüklemiştir. Nanofiberlerin SEM görüntüleri elde edilerek nanofiberlerin yüzeylerinde oluşan altın ve gümüş nanopartikülleri incelenmiştir. Farklı oranlarda nanofiber matrislerin yüzeylerine yüklenen altın ve gümüş nanopartiküllerin SERS etkileri raman spektrumları alınarak incelenmiştir. Daha sonra en yüksek SERS piklerine sahip altın ve gümüş yüklenmiş nanofiberin yüzeyleri flüoresan boya ile boyanmış ve bu yüzeylere E. coli ATCC 25922 süspansiyonu ilave edilerek yüzeylerin bakteri üzerinde etkileri değerlendirilmiştir